分子生物学课件chap2-3_2010

《分子生物学课件chap2-3_2010》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

2.3.9.三股螺旋DNA(TribleHelixDNA,T.SDNA)潜在的专一与DNA(蛋白质)结合的能力※T.SDNA的发现与证实l1953年以前Pauling(Chemist)提出T.SDNA存在的可能性l1953年Watson&CrickD.SDNAmodel证明沿大沟存在多余的氢键给体与受体形成T.SDNA可能性DNA结构领域与Watson竞争，支流?主流? l1957年Davis,Felsenfeld,Rich发现poly(U)+poly(U)+poly(A)T.SRNAT.SDNA的概念l1966年Miller&Sobell实现RNA+D.SDNATriblepolyNtasRepressor关闭基因但由于D.SDNA的提出而被忽视但因证明LacI产物为Repressor而被忽视 ●1975年Perlgut人工合成T.SDNA并证明其Tm值,沉降系数(S)l1987年Mirkin.S.MNature330(495)证明plasmidDNA在pH=4.3的溶液中,有T.SDNA的存在●1987年Dervan.MoserScience238(645)合成S.SDNA+D.SDNA→T.SDNA实现DNA的定点切割研究X-rayphotograph核磁共振→结构功能 继Davis（1957）后30年第一次证明T.SDNA在生物体内的存在 ※T.S.DNA的类型PolyT/ATTTTTTTTTTTAAAAAAAAAAPolyT/ATTTTTTTTTTTAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTAAAAAAAAAA●D.S.DNA+D.S.DNAT.S.DNA+S.S.DNA ●HomologouspalindromicsequenceinaD.S.DNA(mirrorimagestructure)-------TTCCCTCTTTCCC------CCCTTTCTCCCTT-------------AAGGGAGAAAGGG---GGGAAAGAGGGAA----Mirkin(1987)pGG332plasmidDNA--------TTCCCTCTTTCCC----------------AAGGGAGAAAGGG---------------TTCCCTCTTTCCC-----------------AAGGGAGAAAGGG-------NoduleDNAHingedDNAfreeDNA HomologouspalindromicsequenceinaD.S.DNANoduleDNAorHingedDNA三链螺旋双链螺旋HingedDNAHingedDNA lS.S.DNA+D.S.DNAT.S.DNA☆PU+PU/PY(偏碱性介质中稳定)☆PY+PU/PY(偏酸性介质中稳定)常见类型第三条链位于B-DNA的Majorgroove中与D.S.DNA一起旋转 T.S.DNA的连接键WatsonbondingA＝TG≡C(D.S.DNA)H+Hoogsteenbonding第二链的pu6‘,7’与第三链的py4‘,3’形成H键G＝C+(pH小于7)第三链质子化G(6,7)＝G(1,2)A＝AG＝A+A＝T? 三股螺旋DNA形成的条件及结构特点第三条单链DNA分子位于B-DNA大沟内与B-DNA以Hoogsteen键连接在Py/Pu(A,G):Pu(A,G)结构中有多种配对方式，镜向结构,非必需条件TriblehelixMajorgroovePy:Pu:Py3ed在Py/Pu:Py结构中AT,GC两氢键配对C质子化镜相结构必需条件 l无论何种形式的三螺旋DNA,第二股中间链必须是Purin链l第三股链至少长于8dNtl真核生物基因组内,约1%左右的序列为大于100bp的homologouscluster(重复序列与调控序列)T.S.DNA多存在于其中 T.S.DNA可能的功能可阻止调节蛋白与DNA结合,关闭基因转录过程micro－RNAEpigenetic!b)与基因重组,交换有关加入第三条S.S.DNA作为分子剪刀(molecularscissors),定点切割DNA分子d)加入反义的第三条链(anti-sencepolydNt)终止基因的表达 2.3.10.四股螺旋DNA(tetraplexDNA,tetrableHelixDNA，quadruplexDNA)发现1958.Poly(I)X-rayphotograph碱基形成环状氢键连接结构TetrableHelixDNA均有形成四股螺旋DNA的可能5’---TTAGGGTTAGGGTTAGGG-3’3’---AATCCCAATCCC-5’Poly(G),4(dG)染色体端粒高度重复的DNA序列着丝点附近的高度重复序列 结构特点LinkedbyHoogsteenBonding6－17－27GGGG6767766 2×poly(T4G4)2×poly(G4C4)结构特点 GGGGTTTGGGGTTTGGGGTTT真核生物染色体端粒DNA结构G-quadruplex5‘3‘TTTGGGGGGGGGGGGGGGGGGTTTTTT 可能的功能A稳定真核生物染色体结构B保证DNA末端准确复制C与DNA分子的组装有关D与染色体的meiosis&mitosis有关HoogsteenBonding5’-----TTAGGGTTAGGGTTAGGGT3’-----AATCCCAATCCCGGGTA 可能的功能E.G-quadruplex阻止端粒酶对端粒DNA的延伸（因为G-quadruplex不是端粒酶的底物）5’-----TTAGGGTTAGGGTTAGGGT3’-----AATCCCAATCCCGGGTAG-quadruplex的边序直接影响其结构的稳定性! 2.4.基因概念的多样性 2.4.1.生物进化的C值矛盾(Cvalueparadoxofnucleotide)ThetotalamountofDNAinthegenomeofhaploidIsacharacteristicofeachlivingspeciesknownasitsMaximumCvalue(单倍体基因组总DNA的含量)最大C值(MaximumCvalue)ThetotalamountofDNAforencodingthegenesinformationistermeditsMinimumcvalue（编码基因信息的总DNA含量）最小C值(Minimumcvalue) Cvalueparadoxofnucleotide霉菌藻类G+细菌G-细菌显花植物鸟类哺乳类爬行类两栖类硬骨鱼类软骨鱼类棘皮类甲壳类昆虫类软体动物蠕虫类真菌支原体A生物体进化程度高低与大C值不成明显相关（非线性）B亲缘关系相近的生物大C值相差较大C一种生物内大C值与小c值相差极大（Euk.人体c=C/10）(Prok.Φx174c＞C) 2.4.2.重叠基因(overlappinggene)F.Sanger1977X174dntsequencingC=5387bpc=11×2000bp 2.4.2.1基因重叠方式Mis-readingforstopcodon(QRNAvirus1973.A.Weiner)400Nt800NtAUG----------------------UGA-----------------------UAAUGA,UAG易被漏读，错读UAA能严格终止14KdCp97%38KdIp3% X174(F.Sanger,1977)Alternatedifferentreadingframe5387bp11genes3mRNA9peptidesC=5387bpc=11×2000bp---ATG-----//------AATGCC----//---ATAACG---//--TAA----ABATGCCN----NNATAA --------------TCAUGCCCAAACUAGGC--------------StartStopstopstartAlternatedifferentreadingframe ---AUG--------TCAUGCCCAA----AUGAGGC--------------Vp2StartSelectiondifferentstartcodonorstopcodon(SimianVirus40SV40)SV40Vp1StartVp3StartVp1Vp2Vp3 2.4.2.2.种类※I类；反向重叠基因（重叠基因分布在同一DNA区域的不同单链上）IAICIDIB方式？!?!功能？! ※II类；同向重叠基因（重叠基因分布在同一DNA区域的同一单链上）方式？IIAIIBIICIID b)遗传信息量的估算突变效应的鉴定表达调控的理论发展c)丰富和发展了基因的概念(部分回答C=c)2.4.2.3.重叠基因的生物学意义a)原核生物进化的经济原则(较小的C值编码较多的基因信息) 2.4.3重复基因(Repetitivegene) 135001.7×1054.2×106bpK.C.2×10-68×10-23×10-19Cot1/22.4.3.1.重复序列的发现与证实Why? 单一序列长度愈小（重复度愈大）kineticcomplexity(K.C.）愈小Cot(1/2)值愈小，复性愈快poly(A)K.C.=1Cot(1/2)=2×10-6T4DNAK.C.=1.7×105Cot(1/2)=0.3E.coliDNAK.C.=4.2×106bpCot(1/2)=9 C0t(1/2)ofanygenomeDNAC0t(1/2)ofE.ColiDNAKineticComplexityofanygenomeDNAKineticComplexityofE.ColiK.C.与Cot(1/2)值呈正比 K.C.与Cot(1/2)值呈正比poly(A)K.C.=1;Cot(1/2)=2×10-6比例常数K＝K.C./Cot(1/2)=1/2×10-6=5×105K.C.=K×Cot(1/2)T4DNAK.C.=1.7×106;Cot(1/2)=0.3比例常数K≈1.7×106/0.3=5×105E.coliDNAK.C.=4.2×106bp;Cot(1/2)=9比例常数K≈4.2×106/9=5×105 在特定的实验条件下尽管不同的DNA分子K.C.值不同，Cot(1/2)也不相同，但他们的比例常数是相同的K=5×105K.C.与Cot(1/2)值呈正比K.C.=K×Cot(1/2)Bp＝(bp×L/M×S)×(M×S/L)任一DNA分子K.C.＝5×105×Cot(1/2) 1CotCt/C013/605/61/60.110含有复性速率不同的两个以上的组分1/6C/C0=Cot(1/6)1025/6C/C0=Cot(5/6)●真核生物复性动力学研究理想曲线Cot(1/2)=1K.C.=K×Cot(1/2)＝5×105×Cot(1/2)=5×105(Britten&Kohne1968)参与复性的组分是单质的1/6Ct/C0=Cot(1/6)1025/6Ct/C0=Cot(5/6) ●真核生物复性动力学研究C0t1/6C/C0=Cot(1/6)102CalfthymusDNA含有两个以上的K.C.不同的组分5/6C/C0=Cot(5/6)Ct/C06105／61／63／610－2E.ColiDNA30000.0340%60%103CalfthymusDNA C0t(1/2)值矫正40%×0.03=0.01260%×3000=1800C0t(1/2)ofE.ColiDNA=6KineticComplexityofE.Coli=4.6×106C0t(1/2)ofanygenomeDNAC0t(1/2)ofE.ColiDNAKineticComplexityofanygenomeDNAKineticComplexityofE.Coli 60%DNA的总长度=单一序列的KineticcomplexityX=13.8×108bp40%DNA的总长度(chemicalcomplexity)13.8×108bp×4/6=9.2×108bp1800X64.6×106= 40%DNA中单一序列的Kineticcomplexity40%DNA序列中单一序列的重复次数（F）0.012Y64.6×106=Y=9200bpRepetitivefrequency=C.C/K.C=9.2×108bp/9200bp=100,000copies 40%DNA的总长度(chemicalcomplexity)XK.C=1800×5×105bp=9×105bp9×105bp×4/6=6×108bp60%DNA的总长度=单一序列的KineticcomplexityC0t(1/2)值矫正40%×0.03=0.01260%×3000=1800K.C.=K×Cot(1/2) 40%DNA中单一序列的Kineticcomplexity40%DNA序列中单一序列的重复次数（F）Repetitivefrequency=C.C/YK.C=6×108bp/6000bp=100,000copiesYK.C=0.012×5×105bp=6000bpC0t(1/2)值矫正40%×0.03=0.01260%×3000=1800 2.4.3.2重复序列复性的相对性D.S.DNA94℃S.S.DNARenatureatlowC0t(1/2)Hydroxyapatitecolumn高度重复的D.S.DNATm低于该部分天然DNA值S.S.DNARenatureatmiddleC0t(1/2)How? S.S.DNARenatureathighC0t(1/2)单一序列的D.S.DNATm几乎接近该部分天然DNA值中度重复的D.S.DNATm稍低于该部分天然DNA值? Tm接近天然D.SDNA的TmTm低于天然D.SDNA的Tm单一序列的S.S.DNA复性D.S.DNA复性D.S.DNA重复序列的S.S.DNA高C0t(1/2)低C0t(1/2) 结果表明：a)Non-repetitiveS.S.DNARenaturedbyexactlypairingb)RepetitiveS.S.DNAMorerenaturedbypartiallypairingMoreinexactlypairingandmis-pairing天然DNA与复性DNA之间比较∆Tm相差1－1.5度时，预计约有1％的碱基错配 部分配对，错误配对愈多，变性时Tm值愈低PCR,分子杂交中，杂交温度（复性）一般为Tm－(25~30℃)=55~65℃高于55~65℃，为高严谨杂交条件（用于单一序列探针）低于55~65℃，为低严谨杂交条件（用于重复序列探针）Why? 利用水稻基因的探针与玉米根尖染色体细胞学制片进行原位分子杂交时(FISH)，使用玉米C0tDNA进行预杂交，结果发现：玉米DNAC0t值分别为10，50，100时的杂交效果不同，为什么？C0t=10C0t=50C0t=100 2.4.3.3.重复序列分类a)高度重复序列(Highrepetitivesequence)MicrosatelliteDNA2-10bp/copy105-106copies/genomeC0t(1/2)<0.001多为串联重复排列分布于着丝点,端粒区,结构基因两侧heterochromatin5-50copies/genomeMinisatelliteDNA(Variablenumbertandemrepeats.VNTR) 104bpfragmentCsClgradientcentrifugationSequenceinsatelliteDNASeacrab2ATATAT…..Drosophila5ATAATATAAT…..Mouse9GAAAAATGAGAAAAATGAbpofrepeatunitsequenceProkaryoteEukaryote(GC%)42413455MOUSECALF 高度重复序列（micro-satellite）不编码结构基因（功能？）无选择压力（multipleallele可保留在群体中）（有效的分子标记，SSRsimplesequencerepeat）CNV(copynumbervariation)! b)中度重复序列(middlerepetitivesequence)0.1-1Kb/copy10-104copies/genomeC0t(1/2)~0.001-0.1rDNAtDNAAlufamilyHistonegenecluster rDNAgenefamilySeaurchin450copiesTobacco750copiesDrosophila100copiesT18sT5.8sT28sNT18sT5.8sT20s32s28s5.8s45s41s18s不同的生物不同发育时期会发生不同程度的扩增5srDNA5s5s5s5s5s上万次重复 灵长类动物特有的Alufamily人类500,000copies分布于非重复序列间，占基因组5－6％Function?300bp300bp300bp6000bp6000bp6000bp6000bpDRDRIRIRAGCTAlusiteAcopyofAlufamilyTransposon?遗传性疾病Aluexon的发现，表明Alu单元在不危及基因组完整的前提下，具有增强基因组编码容量，产生新基因及调控多能性的进化潜力 middlerepeatgene特点clustergenetandemgeneredundantgene拷贝重复，多量序列多为相似排列成束功能完全相同具有进化的整体性，累积突变rDNAtDNAHistone数量性状基因QTG（量多，微效?效等?累加）不等于中度重复基因 StructureofrepetitivesequenceofDNADRdirectrepeatsIRInvertedrepeatsATCGGCTATAGCCGATBilateralsymmetryATCGNNNNNGCTATAGCNNNNNCGATBilateralsymmetryATCGATCGATCGTAGCTAGCTAGCTandemdirectrepeatsATCGNNNATCGNNNNNNATCGTAGCNNNTAGCNNNNNNTAGCDisperseddirectrepeatsATCGNNNNNCGATTAGCNNNNNGCTAStem-looppalindrome----AAGCTT--------TTCGAA----HindIIIREMirrorStructure ATCGNNNNNNNNCGATATCGTAGCWhenS.S.DNAdNtscontainstwosequencesthatarecomplementary,andformahairpinorstem-loopstructure.StructureofInvertedrepetitivesequence(IR)ofDNA ATCGNNNNNCGATTAGCNNNNNGCTAATCGTAGCCGATGCTAInD.S.DNAsuchstructureconsistoftwocopiesofanidenticalsequencepresentintheinvertedorientation c)单拷贝序列(singlecopysequence,1-3copies)低等真核生物10-20%高等植物80%repetitivesequence高等动物50%多为结构基因 2.4.3.4.重复序列形成的理论a)滚环扩增—突变(Amplification-Mutation)Mutationinsertioncyclingamplification5‘切离环化3‘3‘3‘滚环复制 DNA→RNA→DNAmRNA/cDNADScDNAb)反转座插入(retro-transposition) 跳跃复制saltatoryreplicationCAACMutationin4siteInsertCInserttriplemutationSaltatoryreplication9bprepeat27bprepeat58bprepeat58bprepeat116bprepeat 基因的重复可以通过复制产生（duplication）复制后的拷贝发生突变和突变累积(divergence)形成基因簇genecluster分化成执行不同功能的基因 Geneduplicationisamajorforceinevolution抗病基因簇的形成 不对称交换(unequalcrossing-over) unequalcrossing-over5Units5Units6Units4Units 基因组比较研究禾本科植物基因组比较 ●基因组比较研究表明；5×RicegenomeMaizegenome40×RicegenomeWheatgenome但基因组成，排列表现惊人的相似差异多存在于repetitivesequence﹤﹤ 2.4.4.间隔基因（splittinggene）PhillipSharp&RobertsAd2(1977)（minirevolution）RichardJ.RobertsPhillipA.SharpNobelPrize1993PierreChambon(France)(1977)ovalbuminofchickenEukaryoticcellulargeneisalsosplit2.5.4.1.间隔基因的发现 PhillipA.SharpNobelPrize1993（49y）2006.2.13布什给PhilipSharp颁发国家科技奖章曾获得40项奖励，拥有4个院士称号（美国科学院、美国文理科学院、美国医学研究院、美国哲学研究院） E.coliKeop=1eop=10-4ofλkefficiencyofplating(eop)=10-3ofλcE.coliCλphageeop=1●限制性核酸内切酶的发现1965Arber.W a)E.colirestrictionalienDNAwithrestrictionendonuclease(RE)b)Modificationenzymeinhostc)AlienDNAfateofberestrictedorbemodifiedd)TherearedifferentREindifferenthostofbacterialWernerArberNobelPrize1978 lRestrictionEndonuclease的种类 ●Splittinggene的证实1977PierreChambonOvalbumincDNAasprobeEcoRIHindIIIOviductDNAErythrocyteDNAcDNA中没有HindIII，EcoRI切点！？ Splittingseq.inthe5’endofHexoncpgeneofAd2DNAofAd2+EcoRI&HindIIImRNAofHexoncpSharpgroupRobertsgroup1977AndpresentationinCSHPNAS74:3173,1977 TotalDNAofchickencDNA7DNAloopChambonwasinspiredbyBerget’sreportBerget,S.M.,C.Moore,andP.Sharp.1977.PNAS74;3171-3175 OvalbumincDNAREmapHinfIHinfIIHeaIIIHinfIIIPstIHinfIV(NoEcoRIHindIIIREsite)thecDNAprobebedigestedbyHinfIIIandPstILabelingwithp32ProbeAProbeCProbeB ProbecDNAABCOviducttotalDNADigestedwithEcoRIandHindIIIpresume HinfIHinfIIHeaIIIHinfIIIPstIHinfIVEcoRI,HindIIIEcoRI,HindIIISpacerSpacercDNAmRNApresumeHinfIHinfIIHeaIIIHinfIIIPstIHinfIVDNA转录逆转录虽机会错过但推论正确