欢迎来到天天文库
浏览记录
ID:43810425
大小:2.29 MB
页数:59页
时间:2019-10-15
《分子生物学课件》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、基因操作原理及相关技术Parttwo:1基因操作(genemanipulation)基因工程(geneengineering)遗传工程genecloningmolecularcloning基因操作的核心部分为重组DNA技术。RecombinationDNAtechnology2基因工程与建筑工程生物反应器3DNARecombination1定义:对目的基因进行体外重组,再将重组分子导入受体细胞,使这个基因在受体细胞中复制、转录、翻译表达的过程。克隆(clone):n,无性繁殖系及其后代。基因完全相同;v,指从同一祖先产生这类同
2、一的DNA分子群或细胞群的过程。(Gene,cell,个体)20世纪70年代发展起来的遗传学的一个分支学科。4理论上三大发现:Avery肺炎双球菌转化实验:证实了遗传物质的本质是DNA(1944年)Watson和Crick:提出DNA双螺旋结构模型(1953年)Nirenberg等:确定了遗传信息的传递方向(1961-1966年)DNARNA蛋白质5技术上三大发明:工具酶:分子手术刀,切割与缝合基因,包括限制性内切核酸酶、连接酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶等,对DNA或RNA进行各种各样的修饰。载体(vector,vehicl
3、e):本意是媒介体,在基因工程上指能将目的基因导入宿主细胞的DNA分子。逆转录酶(reversetranscription,RT):打破了中心法则,使真核基因制备成为可能,RT-PCR。RNADNA6genemanipulation过程1、目的基因的获取(PCR,genelibrary);2、载体(vector)的选择与构建(工具酶等);3、目的基因与载体连接,构建重组DNA分子;4、重组DNA导入受体细胞,转化子筛选;5、受体细胞中目的基因的功能表达。7基因工程的基本过程分(合成)、切、连、转、选、鉴8重组DNA技术的意义打
4、破了自然种的界限真核/原核生物间基因的交流对生物进行定向改造基因治疗(基因矫正/添加,RNAi)基因工程药物(生长激素,细胞生长因子,重组疫苗等)9组织纤溶酶原激活物(tissueplasminogenactivator,tPA)Oneexample---10How?载体,工具酶11基因操作的工具酶限制性内切核酸酶(restrictionendonuclease)DNA聚合酶连接酶(Ligase)反转录酶(Reversetranscriptase)碱性磷酸酶(alkalinephosphatase)末端转移酶等121、限制性内
5、切酶定义:是一类能够识别和切割双链DNA分子中特定碱基顺序的核酸水解酶。EcoRI,HandIII,SalI13命名:3-4个字母组成,方式是:属名+种名+株名+序号第1字母(大写)产生该酶细菌的属名的第一字母;第2、3字母(小写)细菌的种名;第4字母(大写)细菌菌株名;罗马数字代表该菌株中发现的第几个酶。EcoRI:EscherichiacoliR(大肠杆菌R株)14限制与修饰(Restriction-modification)细菌体内存在限制和修饰系统(R-M)对自身的DNA进行甲基化修饰,免受自己限制酶的分解,对外来的D
6、NA通过限制性内切酶降解,一般是指对外源DNA侵入的限制。应用:正是对限制和修饰现象的深入研究,导致限制性内切核酸酶的发现,应用甲基化处理保护免受限制性内切酶降解15分类根据限制性内切核酸酶的作用特点,分为三大类。16I类限制性内切核酸酶Ⅲ类限制性内切核酸酶17是基因工程中最常用的酶,该类酶的分子量小,专一性强,切割的方式有平切和交错切。Ⅱ类限制性内切核酸酶:18Ⅱ类限制性内切核酸酶识别序列的长度:一般为4-8个碱基,最常见6个碱基。识别序列的结构:大多数为回文对称结构,切割位点在DNA两条链相对称的位置。回文结构:一条单链以
7、中心轴对折可以形成互补的双链。19粘性末端(cohesiveend)--在DNA双链的不同位置切割DNA,形成有单链突出的末端。平末端(Bluntend)--在DNA双链的相同位置切割DNA分子。限制酶产生的末端:20常用的限制性内切酶21DNA连接酶(ligase)作用:使DNA的3’羟基末端和5’磷酸末端形成3’-5’磷酸二酯键,将两段DNA连接起来种类:T4DNAligase(噬菌体来源)E.coliDNAligase注意:连接DNA片段是否粘端;反应温度(16℃)和时间2223DNA聚合酶复制(DNAReplicati
8、on):亲代DNA双链分子(D.SDNA)在DNA聚合酶的作用下,分别以每单链DNA分子(S.SDNA)为模板,聚合与自身碱基可以互补配对的游离的dNTP,合成两条与亲代分子完全相同的子代DNA分子的过程。24DNA5’…ATGACTG…3’3’…TACTGAC…5’RNA5
此文档下载收益归作者所有