酪氨酸酶催化活性论文

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1、酪氨酸酸酶的提取及催化活性的研究一、实验目的认识生物体中酶的存在和催化作用，了解从土豆中提取酶的方法和研究酶活性的一般方法，学会用现代分析手段研究催化反应，特别是生物化学体系中催化过程的基本思路和方法。二、实验原理许多复杂的有机物合成与分解反应需要在高温、高强酸碱或减压等苛刻条件下才能进行，而在生物体内，即使在十分温和的条件下，如常温、常压和近中性溶液中，许多复杂的化学反应却能顺利进行，其根本原因就是由于生物酶的存在。生物酶是一种生物催化剂，按照它的组成，可分为两类，一类是简单蛋白质，其活性取决于它的

2、结构，如脲酶、淀粉酶等；第二类的结合蛋白质酶，它需要加入某些非蛋白质组分（称为辅助因子）后，才能表现出酶的活性。酶蛋白质与辅助因子结合形成的复合物称为全酶。例如酪氨酸酶是以铜离子为辅助因子的全酶。通常反被酶作用的物质称为该酶的底物，一种酶催化特定的一个或一类底物的反应，具有很高的选择性和灵敏度，因而引起广大分析工作者的重视和兴趣。酶已作为一种分析试剂得到应用。特别是有生化、医学方面有很高的应用价值。例如生命物质和流体中的特殊有机成分，用其他方法测定有困难，用酶法分析却有其独到之处。本实验从土豆中提取酪

3、氨酸酶，并测定其催化活性。当土豆、苹果、香焦等的受损面接触空气后会产生深棕色的现象是人们都见过的，这是这类物质含有酪氨酸和酪氨酸酶，酶存在于物质内部，当暴露在空气中后，在氧气的参与下，会发生一系列反应。以下是主要的反应过程。由于多巴转变成多巴红的反应速率较快，再转到下一步产物速率则慢得多，故可选择多巴转变为多巴红的反应速率的测定来判断催化反应的活性。因多巴红具有特殊的颜色，故可用分光光度法测定，在不同的时刻测定某特定波长下的吸光度，用吸光度对时间作图，从所得的直线斜率求酶的活性。酶的活性计算方法：一般

4、定义在优化的条件下（包括pH值、离子强度、温度等），25℃时在1min内转化1mmol底物所需要催化剂的量为活性单位。通过下式可计算酶的活性：，式中，为所用溶液的酶的活性，为最大吸收波长吸光度的变化，t为时间（min），k为多巴红的摩尔吸收系数，V为加入酶的体积，进而计算出原料（土豆）中酶的活性：。式中A为原料中酶的活性（注意此处A不是吸光度A），V0为原料所得的酶溶液的总体积，m为原料总质量。三、所需主要试剂及仪器1.　试剂及材料酪胺酸：酪氨酸在中性水溶液中溶解度较小，因而配制过程中需加入一定量盐酸

5、溶解。首先取一定酪氨酸配制0.1mol/L酪氨酸储备液，在实验过程中稀释至20mmol/L，使用时需要加入一定量的NaOH调节其pH接近中性。磷酸盐配制的pH=7.2和pH=6.0及pH=5.8的缓冲溶液。称取2.7202gKH2PO4，NaOH0.8003g各自定容于100mL容量瓶中，然后按下面的方法得到所需的缓冲溶液。XmL0.2mol/LKH2PO4＋ymL0.2mol/LNaOH加水稀释至20mLpH5.8251.8606.0252.8507.22517.50酪氨酸的滴定：2mL酪氨酸在指示

6、剂酚酞下1.60mL0.2mol/LNaOH滴定为中性铜试剂：0.1017g定容于100ml容量瓶中。土豆：新鲜土豆2.　仪器分光光度计、离心机、研钵、食物研磨机、恒温水浴、纱布、计时秒表、冰箱等。四、实验步骤1.　酶的提取：取土豆，清洁后切碎，研磨后取2.5mL液体，加入7.5mLpH=7.2的磷酸缓冲溶液，立即高心分离（3000rpm）5min，倾出上层清澈保存于冰箱中，提取液为棕色，在放置过程中不断变黑。2.　酪氨酸的吸收光谱绘制：取0.4mL提取液于10mL比色管，加2mL的酪氨酸溶液，用pH

7、=6.0的缓冲溶液稀释至刻度，摇匀，反应10min后，在分光光度计上取波长240nm-----300nm范围进行扫描，找到最大吸收波长；如图：波长/nm240250260270280290300吸光度0.0710..0730.0750.0760.0780.0710.056故而可以知道最大波长是280nm。3.酶的活性测量取0.4mL提取液于10mL比色管，加2mL的酪氨酸溶液，用pH=6.0的缓冲溶液稀释至刻度，摇匀，同时开始计时，分光光度计在最大吸收波长下测吸光度。开始6min内，每分钟测一次，后隔

8、2min读一次，至吸光度变化不大为止；时间/min0123456吸光度0.0720.0730.0730.0740.0730.0740.0744.酶活性的影响因素①温度，取0.4mL提取液于10mL比色管，加2mL的酪氨酸溶液，用pH=6.0的缓冲溶液稀释至刻度，摇匀，在40℃，50℃，60℃温度下水浴反应10min后，分别测其吸光度，记录如下温度/℃405060吸光度0.0390.0290.025由此可见，不同温度下酶的活性也不同，故而在最适温度下酶的活