酪氨酸酶的提取及其催化活性研究（课件）

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1、酪氨酸酶的提取及其催化活性研究[目的]进一步研究影响酪氨酸催化活性的因素,减少黑色素在生物体内的生成。[方法]以pH值7.2的Na2HPO4-HCl缓冲溶液为体系,用分光光度计在480nm处测定马铃薯提取液的吸光度,以吸光度对时间的变化率(?A/?t)为反应速率,建立多巴溶液的转换动力学曲线,从而可计算出酪氨酸酶的活性。[结果]结果显示,在480nm波长下,以pH值7.2Na2HPO4-HCl缓冲溶液为体系,对测定体系干扰小,所测数据波动小,酪氨酸酶的活性稳定性高,为进一步确定和研究影响酪氨酸酶活性的因素提供了理论依据。[结论]试验以缓冲溶液为底物研

2、究和测定酪氨酸酶的催化活性,准确度高,效果佳。酪氨酸酶是一种多酚氧化酶,具有广泛用途。它主要存在于动植物体中,在它的催化作用下经过一系列的生化反应生成色素。反应式如下:以Na2HPO4-HCl缓冲液为体系,采用分光光度法测定马铃薯中酪氨酸酶的活性,为食品工业加工水果、蔬菜防褐变过程提供参考。1?材料与方法1.1?试验原理?可用比色法测定酪氨酸酶,其活性计算可采用下式:?a=k/(10-6??V?2.5?0.1)式中,a为所用马铃薯溶液的酶的活性,k为多巴红的摩尔吸收系数(即动力学曲线斜率),V为加入的酶体积。从而可用:A=aV0/m计算出所用原料中的

3、酶的活性,其中,A为原料中酶的活性,V0为原料所得的酶溶液的总体积,m为原料总质量。1.2?材料?供试原料为市售马铃薯。仪器:VIS?7220型可见分光光度计(北京瑞利分析仪器公司);电热恒温水浴锅(天津市中环试验电炉有限公司);离心机;秒表。药品:0.01mol/L二羟基苯丙胺酸(多巴)溶液,0.10mol/LNa2HPO4缓冲溶液(pH值7.2和pH值6.0),盐酸。1.3?方法1.3.1?酪氨酸酶的提取[3]。在研钵中放入10.0g切碎的马铃薯,加入7.5mlpH值7.2的缓冲溶液,研磨挤压。滤出提取液,离心分离。倾出上层清液保存于冰浴或冰箱中

4、。1.3.2?酶的活性测定。取6.0ml上述提取液,用pH值7.2的缓冲溶液于10.0ml比色管中稀释至刻度,摇匀。取0.1ml稀释过的提取液于10.0ml比色管中,加入2.9mlpH值6.0的缓冲溶液,再加入2.0ml多巴溶液,用分光光度计在480nm处测定吸光度。开始6min内每分钟读1个数,以后隔2min读1个数,直至吸光度变化不大为止,得吸光度为A1。取0.2,0.3,0.4ml已稀释过的提取液重复上述试验,得吸光度分别为A2、A3、A4。2?结果与分析2.1?酶的动力学曲线的建立?以表1中的吸光度为纵坐标,时间为横坐标,可得出在加入酶的作用

5、下,多巴溶液的转换动力学曲线,再由曲线的直线部分得出直线斜率(即转换速率),由斜率可求出酶的活性。2?2?酶的活性计算?根据公式(其中k是斜率,由图1可知),将不同的k、V值代入公式,可求得提取液中酪氨酸酶的活性,由公式A=a?V0/m(其中V0=6.0ml、m=10.0g,即马铃薯原料的总体积和质量)可得原料马铃薯中酪氨酸酶的活性。表1?不同体积提取液在不同时间下所测的吸光度表2?不同体积提取液得出的原料中酶的活性数据3?结论试验采用分光光度法测定了马铃薯系列提取液在不同时间段的吸光度,通过吸光度建立酪氨酸酶的动力学曲线,可得斜率;由斜率可得出马铃

6、薯提取液及原料中酪氨酸酶的活性,为进一步研究影响酪氨酸酶的活性提供理论依据。酪氨酸酶是一种含铜酶，来源于胚胎神经峭细胞，是黑色素代谢和儿茶酚胺的关键酶，并且是白癜风自身免疫的重要抗原。最近发现部分白癜风患者血清中有酪氨酸酶抗体，且与白癜风临床类型和分期密切相关。提示自身免疫性白癜风发病机制与酪氨酸酶抗体水平有关，为其免疫治疗提供依据，酪氨酸酶抗体可以作为白癜风活动性的一个指标。酪氨酸酶其实是一种铜结合蛋白，所含的离子铜特异性能与人酪氨酸酶结合，一个位点的铜结合可以促进另一个位点的铜结合，组氨酸在铜B位点协调其结合。酪氨酸酶的多肽链的适当折叠对铜结合及

7、其催化活性是关键性的，酪氨酸酶突变可中断铜结合使其催化活性丧失，眼、皮肤白化病是由于酪氨酸酶基因突变所致，该病酪氨酸酶阳性患者色素性皮肤损害发生率高。