大肠菌群计数 标准文本.doc

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1、GBxxxx—xxxxxxxx-xx-xx实施xxxx-xx-xx发布中华人民共和国卫生部发布2010-06-01实施2010-××-××发布食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数（征求意见稿）1GBxxxx—xxxx前言本标准代替GB4789.3-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》、GB/T4789.32-2002《食品卫生微生物学检验大肠菌群的快速检测》和SN/T0169-2010《进出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检测方法》大肠菌群计数部分。本标准与GB4789.

2、3-2010相比，主要变化如下：——增加了检验原理；——修改了典型菌落的形态描述；——MPN法操作步骤中描述了拍击式均质器的均质频率；GBxxxx—xxxx食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数1范围本标准规定了食品中大肠菌群（Coliforms）计数的方法。本标准适用于食品中大肠菌群的计数。2术语和定义2.1大肠菌群coliforms在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。2.2最可能数mostprobablenumber，MPN基于泊松分布的一种间接计数方法。3

3、检验原理3.1MPN法MPN法是统计学和微生物学结合的一种定量检测法。待测样品经系列稀释并培养后，根据其未生长的最低稀释度与生长的最高稀释度，应用统计学概率论推算出待测样品中大肠菌群的最大可能数。3.2平板计数法大肠菌群在固体培养基中发酵乳糖产酸，在指示剂的作用下形成可计数的红色或紫色，带有或不带有沉淀环的菌落。4设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：4.1恒温培养箱：36℃±1℃。4.2冰箱：2℃～5℃。4.3恒温水浴箱：46℃±1℃。4.4天平：感量0.1g。4.5均质器。

4、4.6振荡器。4.7无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。11GBxxxx—xxxx4.8无菌锥形瓶：容量500mL。4.9无菌培养皿：直径90mm。4.10pH计或pH比色管或精密pH试纸。4.11菌落计数器。5培养基和试剂5.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LaurylSulfateTryptose，LST）肉汤：见附录A中A.1。5.2煌绿乳糖胆盐（BrilliantGreenLactoseBile，BGLB）肉汤：见附录A中A.2。5.3结晶紫中性红胆盐琼

5、脂（VioletRedBileAgar，VRBA）：见附录A中A.3。5.4磷酸盐缓冲液：见附录A中A.4。5.5无菌生理盐水：见附录A中A.5。5.6无菌1mol/LNaOH：见附录A中A.6。5.7无菌1mol/LHCl：见附录A中A.7。11GBxxxx—xxxx第一法大肠菌群MPN计数法6检验程序大肠菌群MPN计数的检验程序见图1。检样25g(mL)样品+225mL稀释液，均质10倍系列稀释选择适宜3个连续稀释度的样品匀液，接种LST肉汤管48h±2h36℃±1℃不产气产气BGLB肉汤48h±2h

6、36℃±1℃不产气产气大肠菌群阴性大肠菌群阳性查MPN表结果报告图1大肠菌群MPN计数法检验程序7操作步骤7.1样品的稀释7.1.1固体和半固体样品：称取25g样品,放入盛有225mL11GBxxxx—xxxx磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内,8000r/min～10000r/min均质1min～2min,或放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器以6次/s～9次/s拍打1min～2min，制成1:10的样品匀液。7.1.2液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225

7、mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中充分振摇或置于机械振荡器中振摇，充分混匀，制成1:10的样品匀液。7.1.3样品匀液的pH值应在6.5～7.5之间，必要时分别用1mol/LNaOH或1mol/LHCl调节。7.1.4用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。7.1.5根据对样品污

8、染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。7.2初发酵试验每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1mL，则用双料LST肉汤），36℃±1℃培养24h±2h，观察倒管内是否有气泡产生，24h±2h产