滤膜法测定总大肠菌群.doc

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1、.....................最新资料整理推荐.....................滤膜法测定总大肠菌群1主题内容与适用范围   本方法规定了生活饮用水中总大肠菌群的滤膜测定方法。   本方法适用于生活饮用水和低浊度的水源水中总大肠菌群数的测定。   2方法提要   用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤水样，细菌被截留在滤膜上，将滤膜贴在选择性培养基上，经培养后，计数生长在滤膜上的典型大肠菌群菌落数。   3培养基与试剂   3.1品红亚硫酸钠培养基   3.1.1成份   A蛋白胨10g   B酵母浸

2、膏5g   C牛肉膏5g   D乳糖10g   E琼脂15~20g   F硫酸氢二钾3.5g   G无水亚硫酸钠5g左右   H碱性品红乙醇溶液(50g/L)20mL   I蒸馏水1000mL   3.1.2储存培养基的制备5.....................最新资料整理推荐.....................   先将琼脂加到500mL蒸馏水中，煮沸溶解，于另500mL蒸馏水中加入硫酸氢二钾、蛋白胨、酵母浸膏和牛肉膏，加热溶解，倒入已溶解的琼脂，补充蒸馏水至1000mL，混匀后调pH为7.2~7.4，

3、再加入乳糖，分装，115℃高压灭菌20min，储存于冷暗处备用。   3.1.3平皿培养基的配制   将上法制备的储存培养基加热融化，用灭菌吸管按比例吸取一定量的5％碱性品红乙醇溶液置于灭菌空试管中，再按比例称取所需的无水硫酸钠置于另一灭菌试管中，加灭菌水少许，使其溶解后，置沸水浴中煮沸10min以灭菌。   用灭菌吸管吸取已灭菌的亚硫酸钠溶液，滴加于碱性品红乙醇溶液至深红色退成淡粉色为止，将此亚硫酸钠与碱性品红的混合液全部加到已融化的储存培养基内，并充分混匀(防止产生气泡)，立即将此种培养基15mL倾入已灭菌的空平

4、皿中。待冷却凝固后置冰箱内备用。此种以制成的培养基于冰箱内保存不宜超过二周。如培养基已由淡粉色变为深红色，则不能再用。   3.2乳糖蛋白胨培养基   3.2.1成份   A蛋白胨10g   B牛肉膏3g   C乳糖5g   D氯化钠5g   E溴甲酚紫乙醇溶液(16g/L)1mL5.....................最新资料整理推荐.....................   F蒸馏水1000mL   3.2.2制法   将蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化钠溶于蒸馏水中，调整pH为7.2~7.4，再加入1mL1.

5、6％溴甲酚紫乙醇溶液，充分混匀，分装于装有倒管的试管中，115℃高压灭菌20min，贮存于冷暗处备用。   4仪器   4.1滤器。   4.2滤膜，孔径0.45~0.65μm。直经根据滤器规格，目前常用的有3.5cm和4.7cm两种。   4.3抽滤设备。   4.4无齿镊子。   4.5培养箱:36±1℃。   4.6冰箱:0~4℃。   4.7天平。   4.8显微镜。   4.9平皿:直径为9cm。   4.10灭菌刻度吸管:1mL,10mL。   5检验步骤   5.1准备工作   5.1.1滤膜灭菌:  

6、 将滤膜放入烧杯中，加入蒸馏水，置于沸水浴中煮沸灭菌三次，每次15min。前两次煮沸后需更换水洗涤2~3次，以除去残留溶剂。5.....................最新资料整理推荐.....................   5.1.2滤器灭菌:用点燃的酒精棉球，火焰灭菌。也可用121℃高压灭菌20min。   5.2过滤水样   用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分，将粗糙面向上，帖放在已灭菌的滤床上、，固定好滤器，将100mL水浴(如水样含菌数较多，可减少过滤水样量，或将水样稀释)注入滤器中，打开滤器阀门，在负0

7、.5大气压下抽滤。   5.3培养   水样滤完后，再抽气约5s，关上滤器阀门，取下滤器，用灭菌镊子夹取滤膜边缘部分，移放在品红亚硫酸钠培养基(36.1.3.1)上，滤膜截留细菌面向上，滤膜应与培养基完全贴紧，两者间不得留有气泡，然后将平皿倒置，放入37℃恒温箱内培养22~24h。   6观察结果   6.1挑出符合下列特征菌落进行革兰氏染色、镜检。   紫红色，具有金属光泽的菌落。   深红色，不带或略带金属光泽的菌落。   淡红色，中心色较深的菌落。   6.1.1凡革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌，再接种乳糖蛋白胨

8、培养基液，于37℃培养24h，有产酸产气者，则判定为总大肠菌群阳性。   6.1.2计算滤膜上生长的总大肠菌群数，以每100mL5.....................最新资料整理推荐.....................水样中的总大肠菌群数报告之(CFU/100mL)   总大肠菌群菌落数(CFU/100mL)＝───────────