总大肠菌群数量测定.doc

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1、总大肠菌群在饮用水的微生物安全监测中，普遍采用正常的肠道细菌作为粪便污染指标，而不是直接测定肠道致病菌。总大肠菌群系指一群需氧及兼性厌氧的，在37℃生长时能使乳糖发酵，在24h内产酸产气的革氏阴性无芽胞杆菌。总大肠菌群系指每升水样中所含有的总大肠菌群的数目。总大肠菌群可用多管发酵法或滤膜法检验。一多管发酵法1应用范围1.1本法适用于饮用水、水源水，特别是浑浊度含量高的水质中总大肠菌群的测定。1.2水样中总大肠菌群数的含量，表明水被粪便污染程度，而且间接地表明有肠道致病菌存在。2原理根据总大肠菌群应具有的生物特性，如

2、革兰氏阴性无芽胞杆菌，在37℃24h内能发酵乳糖并产酸产气，能在选择性培养基上产生典型菌落。3仪器3.1显微镜3.2革兰氏染色用有关器材。3.3高压蒸汽灭菌器。3.4干热灭菌箱。3.5恒温箱。3.6冰箱。3.7放大镜。3.8试管、平皿（直径9cm）、刻度吸管等，置于干热灭菌箱中160℃灭菌2h4培养基4.1乳糖蛋白胨培养液4.1.1成分蛋白胨10g牛肉膏3g乳糖5g氯化钠5g1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1ml蒸馏水1000ml4.1.2制法将蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化钠置于1000ml蒸馏水中加热溶解，调整pH为7.2

3、~7.4，再加入1ml1.6%溴甲酚紫乙醇溶液，充分混匀，分装于装有倒管的试管中，置高压蒸汽灭菌器中，以115℃灭菌20min，贮存于冷暗处备用。4.2三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液按上述乳糖蛋白胨培养液浓缩三倍配制。4.3品红亚硫酸钠培养基（供多管发酵法用）4.3.1成分蛋白胨10g乳糖10g磷酸氢二钾3.5g琼脂15~30g蒸馏水1000ml无水亚硫酸钠5g左右5%碱性品红乙醇溶液20ml4.3.2储备培养基的制备先将琼脂加至900蒸馏水中，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾及蛋白胨，混匀使之溶解，再以蒸馏水补足至1000

4、ml，调整PH值为7.2~7.4，趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入乳糖，混匀后定量分装于烧瓶内，置高压蒸汽灭菌中以115℃灭菌20min，贮存于冷暗处备用。4.3.3平皿培养基的配制将上法制备的储备培养基加热融化，根据烧瓶内培养基的容量，用灭菌吸管按比例吸取一定量的5%碱性品红乙醇溶液，置于灭菌空试管中。再按比例称取所需的无水亚硫酸钠置于另一个灭菌空试管内，加灭菌水少许使其溶解后，置于沸水浴中煮沸10min以灭菌。用灭菌吸管吸取已灭菌的严硫酸钠溶液，滴加于碱性品红乙醇溶液内至深红色褪成淡粉红色为止。将此亚硫酸钠与碱性

5、品红的混合液全部加入已融化的储备培养基内，并充分混匀（防止产生气泡），立即将此种培养基适量倾入于已灭菌的空平皿内，待其冷却凝固后置冰箱内备用。此种已制成的培养基于冰箱内保存不宜超过二周，如培养基已由淡红色变成深红色，则不能再用。4.4伊红美蓝培养基4.4.1成分蛋白胨10g乳糖10g磷酸氢二钾2g琼脂20~30g蒸馏水1000ml2%伊红水溶液20ml0.5%美蓝水溶液13ml4.4.2储备培养基的制备先将琼脂加至900ml蒸馏水，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾及蛋白胨，混匀使之溶解，再以蒸馏水补足至1000ml，调

6、整PH为7.2~7.4。趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入乳糖，混匀后定量分装于烧瓶内，置高压蒸汽灭菌器内以115℃灭菌20min，贮存于冷暗处备用。4.4.3平皿培养基的制备将上法制备的储备培养基加热融化，根据烧瓶内培养基的容量，用灭菌吸管按比例吸取一定量已灭菌的2%伊红水溶液及一定量已灭菌的0.5%美蓝水溶液，加入已融化的储备琼脂内，并充分混匀（防止产生气泡）立即将此种培养基适量倾入于已灭菌和空平皿内，待其冷却凝固后置冰箱内备用。5步骤5.1生活饮用水5.1.1初发酵试验：在2个各装有已灭菌50ml三倍浓缩乳糖蛋白

7、胨培养液（4.2）的大试管或烧瓶中（内有倒管）内，以无菌操作各加入水样100ml；在10支装有已灭菌5ml三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的试管中（内有倒管），以无菌操作各加入水样10ml，混匀后置于37℃恒温箱内培养24h。5.1.2平板分离：经培养24h后，将产酸产气及只产酸的发酵管，分别接种于品红亚硫酸钠培养基或伊红美蓝培养基上，再置于37℃恒温箱内培养18~24h，挑选符合下列特征的菌落，取菌落的一小部分进行涂片、革兰氏试验、镜检。品红亚硫酸钠培养基上的菌落：紫红色，具有金属光泽的菌落。深红色，不带或略带金属光泽的

8、菌落。淡红色，中心色较深的菌落。伊红美蓝培养基上的菌落：深紫黑色，具有金属光泽的菌落。紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落。淡紫红色，中心色较深的菌落。5.1.3复发酵试验：上述涂片镜检的菌落如为革兰氏阴性无芽胞杆菌，则挑取该菌落的另一部分再接种于普通浓度乳糖蛋白胨培养液中（内有倒管），每管可接种分离自同一初发酵管的最典型的菌落1~3个，然后置于37℃恒温箱中培