多管发酵法测定水中大肠菌群

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1、实验九多管发酵法测定水中大肠菌群一目的要求二基本原理三实验材料四操作步骤五实验报告一目的要求1学习测定水中大肠菌群数量的多管发酵法2了解大肠菌群的数量在饮水中的重要性▲保证水中不存在肠道传染病的病原菌▲天然水体中的病原菌很可能是受粪便污染带入。▲只检测水中是否有肠道正常细菌存在，而不直接检测水中的病原菌。我国《生活饮用水卫生标准》GB5749-85中关于生活饮用水的细菌标准的具体规定如下：1细菌总数1ml水中不超过100个。2大肠杆菌数1L水中不超过3个。3若只经过加氯消毒即供作生活饮用水的水源水，大肠菌群数平均每升不得超过1000个；经过净化处理及加氯消毒后供作生活饮用水的水源水，大肠

2、菌群数平均每升不得超过10000个。二基本原理多管发酵法包括三个部分▲初发酵试验▲平板分离▲复发酵试验1初发酵实验发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置杜氏小套管。乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气。为便于观察细菌的产酸情况，培养基内加有溴甲酚紫作为PH指示剂，细菌产酸后，培养基即由原来的紫色变为黄色。溴甲酚紫还有抑制其他细菌如芽孢菌生长的作用。水样接种于发酵管内，37℃下培养：（1）24h内小套管中有气体形成，并且培养基混浊，颜色改变，说明水中存在大肠杆菌，疑为阳性结果；（2）在量少的情况下，也可能延迟48h后才产酸产气，此时应视为可疑结果。以

3、上两种结果均需继续做下面两部分实验，才能确定是否是大肠菌群。（3）48h后仍不产气的为阴性结果。2平板分离平板培养基使用伊红美蓝琼脂（eosinmethyleneblueagar，EMBagar）。伊红美蓝琼脂平板含有伊红和美蓝染料，在此亦作为指示剂，大肠菌群发酵乳糖造成酸性环境时，该两种染料即结合成复合物，使大肠菌群产生带核心的、有金属光泽的深紫色（龙胆紫的紫色）阳性菌落。初发酵管24h内产酸产气和48h产酸产气的均需在以上平板上划线分离菌落。3复发酵试验以上大肠菌群阳性菌落，经涂片革兰氏染色为革兰氏阴性无芽孢杆菌者，通过此试验再进一步证实。原理与初发酵试验相同，经24h培养产酸又产气

4、的，最后确定为大肠菌群阳性结果。大肠菌群水样初步产酸厌氧芽孢杆菌接种发酵产气好氧芽孢杆菌鉴平别板培分养离基产酸复发酵大肠菌群革兰氏产生大肠菌群产气染色典型菌落好氧芽孢杆菌革兰氏阴性无芽孢阳性管三试验材料采集的水样：河水、池水、湖水等水源水培养基：▲普通浓度乳糖蛋白胨发酵管（内有倒置小套管）▲三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管（瓶）（内有倒置小套管）▲灭菌水▲伊红美蓝琼脂平板四操作步骤1水样的采取2池水、河水湖水等水源水的检测（1）稀释水样：原水样10-110-2（2）初步发酵试验——接种水样混匀后，37℃培养24h，24h未产气的继续培养至48h。水样稀释及接种1ml1ml9ml10ml100ml

5、无菌水10-110-2水源水1ml1ml1ml5ml50ml3倍浓缩乳糖蛋白胨10ml普通浓度乳糖蛋白胨发酵管（3）平板分离经24h培养后，将产酸产气及48h产酸产气的发酵管（瓶），分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板上，再于37℃下培养24h，将符合下列特征的菌落的一小部分，进行涂片，革兰氏染色，镜检。①　深紫黑色、有金属光泽。②　紫黑色、不带或略带金属光泽。③　淡紫红色、中心颜色较深。（4）复发酵试验经涂片、染色、镜检，如为革兰氏阴性无芽孢杆菌，则挑取该菌落的另一部分，重新接种于普通浓度的乳糖蛋白胨发酵管中，每管可接种来自同一初发酵管的同类型菌落1--3个，37℃培养24h，结果若产酸又产

6、气，即证实有大肠菌群存在。同类型菌落①　深紫黑色、有金属光泽。②　紫黑色、不带或略带金属光泽。③　淡紫红色、中心颜色较深。证实有大肠菌群存在后，再根据复发酵的阳性管（瓶）数查表，即得每升水样中的大肠菌群数。▲将100、10、1、0.1（10-1）ml水样的发酵管结果查表3▲将10、1、0.1（10-1）、0.01（10-2）ml水样的发酵管结果查表4五实验报告实验课程论文封面格式《水处理微生物学》课程实验所在班级：学生姓名：任课教师：实验时间：实验课程论文格式：题目1实验目的2基本原理3实验内容4实验步骤和方法5结果记录6结果分析7参考文献1池水、河水或湖水中每升水样中大肠菌群数阳性结果

7、记“+”；阴性结果记“-”。查表3得每升水样中大肠菌群数是多少？查表4得每升水样中大肠菌群数是多少？水样管/ml发酵结果1001010.10.012思考题(1)大肠菌群的定义是什么?(2)EMB培养基含有哪几种主要成分？在检查大肠菌群时，各起什么作用？存在于肠道中的正常菌群,在正常生理情况下不致病.（1）大肠埃希氏杆菌（Escherichiacoli）E.coli（2）产气杆菌（Aerobacteraerogenes）（3）枸橼酸盐