最新洗脱条件的选择ppt课件.ppt

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1、洗脱条件的选择谷胱甘肽转硫酶简介谷胱甘肽转硫酶（GlutathionS-transferases，简称GSTs，EC2.5.1.18）广泛存在于动物和人体的各种组织，哺乳动物肝脏中含量最高，约占肝可溶性蛋白的10%。GST是机体内一组具有重要解毒作用的同工酶家族，均为由两个亚基组成的二聚体，相对分子质量为45000—49000，各同工酶的等电点不同，多为碱性同工酶。2兔肝匀浆液及纯化样品SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱3亲和层析法分离生物大分子示意图配基待分离的生物分子a.载体手臂配基亲和吸附剂b.7

2、d.与待分离物质专一可逆结合的物质c.样品杂质8亲和层析介质的制备配基的选择：选择合适的配基是亲和层析中的重要环节，配基可以是有机小分子、生物大分子、染料等。根据待分离物质在溶液中与配基之间的亲和力的大小和专一性等特性进行选择，通过实验来确定理想的配基。例如选择酶的竞争性抑制剂、底物和辅助因子类配基可以纯化酶，选择互补的碱基序列、组蛋白、核酸聚合酶、核酸结合蛋白类配基可以纯化核酸等等。在亲和层析中，分离生物大分子的配基必须有适当的化学基团能与活化基团发生偶联作用，有较高的偶联率，偶联后配基和被分离生

3、物大分子的专一结合特性不变，有效地分离目标产物；解吸附时不破坏生物大分子的生物活性和理化性质。9载体的选择：亲和层析的载体一般是凝胶类层析介质。一般比较理想的载体应具备稀松的多孔网状结构，对于溶液具有良好的亲水性、流动性和渗透性，大孔径凝胶介质可以有效地使凝胶内部的羟基得到活化，以保证较高的活化效率，提高了配基的有效浓度，提供较高的亲和容量；必须有足够数量的化学基团，经化学方法活化后，可以与大量的配基相偶联；具有良好的机械性能，保证亲和柱维持较好的流速；必须是不溶于水、化学惰性的，非特异性吸附作用弱

4、；有良好的物理和化学的稳定性，在配基偶联、亲和层析、再生处理过程中不会因离子强度、温度、pH的变化，变性剂、去污剂的应用而破坏载体的物理化学结构，在介质的反复使用过程中能抗微生物和酶的侵蚀。10琼脂糖凝胶：目前应用最多的琼脂糖凝胶是瑞典Pharmacia公司生产的Sepharose，它具有理想载体的特性。它是由D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖交替结合而成的大分子多聚糖，靠糖链之间的次级键交联成的稳定网状结构的珠状凝胶，网状结构的疏密依靠改变琼脂糖浓度的方法来控制。如Sepharose2B，4B和

5、6B，其中阿拉伯数字表示凝胶中干胶的百分含量，机械强度随凝胶浓度降低而减弱。目前广泛使用Sepharose4B来分离生物大分子，本实验采用的是本院自己研制的SepharoseQT4，相当于Sepharose4B。琼脂糖凝胶的多聚合链不是由共价键连接而成的，在使用中应当注意的问题有受热失去稳定性，引起部分溶解，故不宜加热消毒，低温保存，冻结会破坏其结构，要避免在pH低于4高于9下长期工作，使用破坏氢键的试剂会降低凝胶的稳定性，一般情况下不能进行干燥，适宜湿态保存。11常用活化剂：活化剂一般用溴化氰和环

6、氧氯丙烷较多，二者各有利弊：(1)溴化氰：溴化氰活化载体是目前用得最多、效果最好的活化方法。活化效率高，速度快。缺点是溴化氰容易分解产生剧毒的氢氰酸及溴，活化臂短，不利于生物大分子的结合。(2)环氧氯丙烷：环氧氯丙烷活化效率高，活化臂较长，有利于生物大分子的结合。毒性很小，可以在常规条件下操作。缺点是活化温度较高，45－50℃，活化时间较长。12偶联条件的选择：(1)偶联pH值：配基偶联最佳pH在8-10之间最有效，在这个pH范围内配基上的氨基多是非质子化形式，要尽可能地选用碱性条件。但是在高pH值

7、时，可能会改变配基的高级结构，甚至丧失活性，所以在偶联时pH的选择要根据具体情况而定。(2)偶联温度和时间：溴化氰活化的载体，一般都在4℃左右偶联过夜，也可以室温（20-25℃）下反应2h。环氧氯丙烷活化的载体，一般在35－45℃偶联。偶联时间要根据配基的浓度来确定，一般情况要16－24小时。(3)偶联配基的浓度：偶联时并不总是需要大量的配基才能制成高效的亲和吸附剂，高浓度配基的偶联可以增加结合强度、空间位阻和非特异性结合，空间位阻可以引起亲和吸附剂结合效率的降低，尤其是当高浓度大分子蛋白被偶联时。

8、对于多数亲和吸附剂选用的配基浓度是1-20µmol/mLgel，2µmol/mL是最常用的配基使用量。13亲和层析技术吸附条件的选择：纯化生物大分子一般采用柱层析吸附法，根据亲和吸附剂的吸附容量和待分离物质的总量选择大小合适的层析柱。选择吸附条件时要考虑平衡缓冲液的组成、pH范围和离子强度，样品上柱的体积、温度和流速等因素，使亲和介质与被分离物质具有较强的亲和力。样品溶液的pH和离子强度要与平衡缓冲液一致，一般接近中性。假如样品中杂质多，纯化对象与配基结合力弱时，可以