最新抗菌药物筛选的实验方法与技术教案教学讲义PPT.ppt

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1、抗菌药物筛选的实验方法与技术教案一个新的化合物或分离提取有效成分是否有抗菌作用，需要药理实验来证实，首先采用体外实验方法，观察试验物对细菌有无杀灭作用或抑制作用，体外实验的重要性在于方法简便，用药量少，短时间内能判断药物抗菌的广度和强度，为深入体外实验和体内药效研究提供数据。体外实验是筛选抗菌药物或测试新药抗菌性能的重要环节。药物对细菌代谢的影响、可以使细胞呼吸量减低，或酶系统受到抑制等，因而出现细菌不生长或部分抑制，可借以判断药物对细菌有无抗菌作用，或抗菌范围。体外实验是细菌与药物直接接触，没有机体诸因素

2、参与，故体外和体内实验的结果不一定完全一致，需两方面综合分析进行评价。一、实验目的1，掌握培养基的制备、高压蒸气灭菌、菌种培养、接种等微生物培养技术；2，掌握化合物抗菌、抑菌活性筛选技术；3，掌握微孔板法、抑菌圈法抗菌最小浓度测试等基本操作技术。4，学会使用各种仪器设备。实验中使用的仪器设备：1，手提式高压蒸汽灭菌锅；2，超净工作台；3，各种移液器；4，细菌恒温培养箱；5，微生物培养摇床；6，酶标仪；2，培养基的分装液体培养基装入试管培养基的量视试管大小及需要而定，若所用试管大小为15×150mm时，液体培

3、养基可分装至试管高度1/4左右为宜（约5ml）；分装团体培养基时，在琼脂完全融化后，应趁热分装于试管中分装量为管高1/5(约4-5ml)。3，棉塞的制作及试管、锥形瓶的包扎（1）试管棉塞的制作制棉塞时，应选用大小、厚薄适中的普通棉花一快，铺展于左手拇指和食指如成的圆孔上，用右手食指将棉花从中央压入团孔中制成棉塞，然后直接压入试管或锥形瓶口。将装好培养基并塞好棉塞或盖好管帽的试管捆成—捆，外面包上一层牛皮纸。用铅笔注明培养基名称及配制日期。灭菌待用。4，培养基的灭菌高压蒸汽灭菌是微生物学实验、发酵工业生产、以

4、及外科手术器械等方面最常用的一种灭菌方法。（1）打开灭菌锅盖，加适量水；（2）将待灭菌物品放入灭菌桶内。（3）将盖上的软管插入灭菌桶的槽内，加盖，上下螺栓口对齐，均匀旋紧螺栓，使锅密闭。（4）打开放汽阀，加热，自锅内开始产生蒸汽后再关紧放汽阀，待压力逐渐上升至所需温度时，控制热源，维持所需压力和温度，并开始计时20min后停止加热。（5）待压力降至接近0时，慢慢打开放汽阀(排汽口)，开盖，立即取出灭菌物品。5，斜面和平板的制作将巳灭菌装有琼脂培养基的试管，趁热置于木棒上，使成适当斜度，凝固后即成斜面(图1-

5、3)斜面长度不超过试管长度1/2为宜。平板的制作6，斜面培养基接种斜面培养基接种法一般不用作分离培养，仅使细菌繁殖为菌种传代或观察其某些生化特性之用。(1)接种灭菌(2)开启棉塞(3)管口灭菌(4)挑起菌苔(5)接种(6)塞好棉塞。7，液体培养基接种法三、微量稀释法体外抗菌实验连续稀释法（试管稀释法）通常用于测定微生物的最小抑菌浓度（MIC），即将微生物的浓度按几何级数或数学级数进行递减稀释，然后将不同浓度的微生物混入含试验菌的液体培养基或固体培养基中，经培养后，能抑制试验菌生长的最低浓度，即为该微生物的最

6、小抑菌浓度。微量稀释法此种方法常用于测定细菌对药物敏感性或新药对细菌的抗菌活性试验。一般应用96孔微量稀释板，孔底呈U型，每孔容量为0.20-0.30ml。本法操作较便，用培养基量少，可作大批量药敏试验。(一）实验过程（1）实验菌的准备。选取大肠杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylicoccusaureus)、白色葡萄球菌(Staphylococcusalbus)、蜡状芽孢杆菌菌种在营养琼脂斜面培养基上传代培养一次后，再将其接种至营养肉汤培养基中37℃培养6-12h，冰箱备

7、用。（2）抗菌化合物的初步筛选，按下表取96孔培养板一块，进行编号，将44种化合物（由有机化学研究所其他教师和研究生提供）用DMSO或蒸馏水配制成50mol/ml，（也可用无菌过滤器过滤后）放置在灭菌的小离心管中。筛选实验过程（3）在超净工作台内，酒精灯下，将液体培养的细菌菌种用培养液进行稀释，稀释度为1：1000或1:500。用无菌的移液器（吸咀经过灭菌处理）将稀释的液体菌种198l加入到除了A1,B1以外的孔内，2l各种化合物溶液（DMSO配置），A1,B1,C1,D1加200l培养液，震荡混合

8、后37℃培养12h-18h,用酶标仪630nm侧吸光度。DMSO的最终浓度保持在1%。每个样品设两个平行孔。96孔细胞培养板加样安排123456789101112A培养液200l样品1234567891011B培养液200l样品1234567891011C培养液200l样品1213141516171819202122D培养液200l样品1213141516171819202122E菌对照(2lDMSO)