最新PCR技术原理幻灯片.ppt

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1、进入夏天，少不了一个热字当头，电扇空调陆续登场，每逢此时，总会想起那一把蒲扇。蒲扇，是记忆中的农村，夏季经常用的一件物品。　　记忆中的故乡，每逢进入夏天，集市上最常见的便是蒲扇、凉席，不论男女老少，个个手持一把，忽闪忽闪个不停，嘴里叨叨着“怎么这么热”，于是三五成群，聚在大树下，或站着，或随即坐在石头上，手持那把扇子，边唠嗑边乘凉。孩子们却在周围跑跑跳跳，热得满头大汗，不时听到“强子，别跑了，快来我给你扇扇”。孩子们才不听这一套，跑个没完，直到累气喘吁吁，这才一跑一踮地围过了，这时母亲总是，好似生气的样子，边扇边训，“你看热的，跑什么？”此时这把蒲扇，是那么凉快，那么的温馨幸福，有母亲的

2、味道！　　蒲扇是中国传统工艺品，在我国已有三千年多年的历史。取材于棕榈树，制作简单，方便携带，且蒲扇的表面光滑，因而，古人常会在上面作画。古有棕扇、葵扇、蒲扇、蕉扇诸名，实即今日的蒲扇，江浙称之为芭蕉扇。六七十年代，人们最常用的就是这种，似圆非圆，轻巧又便宜的蒲扇。　　蒲扇流传至今，我的记忆中，它跨越了半个世纪，也走过了我们的半个人生的轨迹，携带着特有的念想，一年年，一天天，流向长长的时间隧道，袅PCR技术原理定义：PCR技术又称聚合酶链式反应（polymerasechainreaction)，是通过模拟体内DNA复制的方式，在体外选择性地将DNA某个特殊区域扩增出来的技术。PCR技术:

3、PCR概念的提出1983，KaryMullis此酶具有以下特点：①耐高温，②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。酶命名为TaqDNA多聚酶(TaqDNAPolymerase)。此酶的发现使被PCR广泛应用。在1989年，Science将PCR中的TaqDNA多聚酶命名为当年的风云分子(Molecule of the year)1、PCR技术的基本原理在微量离心管中,加入适量的缓冲液,微量的模板DNA,四种脱氧单核苷酸,耐热性多聚酶,一对合成DNA的引物,通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环

4、的反应过程,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍;扩增了特异区段的DNA带。一、PCR技术的基本原理和工作方式①94℃变性②50-65℃退火③72℃延伸2.PCR反应过程：20-40个PCR循环1个PCR循环PCR扩增原理引物延伸延伸5’5’3’3’变性、退火变性、退火①模板：单链或双链DNA②引物：16-30bp合成的寡核苷酸③DNA聚合酶：耐热的DNA聚合酶④底物：四种脱氧三磷酸核苷（dNTP:dATP、dTTP、dCTP、dGTP)⑤Mg2+：DNA聚合酶的激活剂3.PCR基本要素4.PCR反应程序⑴94~96℃30’’-3’

5、预变性（使模板DNA充分变性）⑵94℃30’’变性⑶50-60℃30’’-1’复性（使引物与模板充分退火）⑷72℃n’(按1’扩增1kb计算）延伸⑹72℃3-7’总的延伸（使产物延伸完整）⑺4-10℃保存⑸25-35个循环1）复性和延伸温度复性的温度是PCR扩增是否顺利的关键因素，通常在50-60℃之间。具体的温度主要由引物的Tm值决定（低于Tm值2-3℃）。延伸温度绝大多数设定为72℃。如果复性的温度很高，可以将延伸温度和复性温度设置成同一温度，变成二步法PCR。2）反应时间变性一般使用30秒钟，如果模板的G+C含量较高，或直接用细胞做模板，变性时间可适当延长。复性时间有30秒种一般是

6、足够的。延伸时间由扩增产物的大小决定，一般采用1kb用1分钟来保证充足的时间。3）循环次数循环次数主要与模板的起始数量有关，循环数通常为25～35次。平台效应（plateaueffect）：PCR扩增过程后期出现的产物的积累按减弱的指数速率增长的现象。原因：底物和引物的浓度已经降低，dNTP和DNA聚合酶的稳定性或活性降低，产生的焦磷酸会出现末端产物抑制作用，非特异性产物或引物的二聚体出现非特异性竞争作用，扩增产物自身复性，高浓度扩增产物变性不彻底。4）PCR反应液的配制最后加入DNA聚合酶。早期的PCR仪没有带加热的盖子，要求在反应液上覆盖一层矿物油，防止水分蒸发。热启动（hotsta

7、rt）PCR操作方式可较好解决非特异性扩增的问题。总体积50-100l①缓冲液②dNTP（底物）③引物④模板⑤DNA聚合酶5、反应体系①缓冲液：提供合适的PH值和DNA聚合酶的激活剂10mMTris·HCl（pH8.3-9.0），1.5mMMgCl2，50mMK+②dNTP（底物）：等摩尔浓度的4种dNTP（即dATP、dTTP、dCTP和dGTP），终浓度一般为200mM（即饱和浓度），dNTP的浓度会影响扩增的产量、特异性和忠