最新ELISA方法学评价教学讲义PPT课件.ppt

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1、ELISA方法学评价学习内容（一）与方法或仪器性能有关的参数（二）定性实验方法的评价（三）范例介绍—ELISA法检测前S1抗原的方法学评价特异性空白读数检出限精密度试剂稳定性等与方法或仪器性能有关的参数准确度回收实验干扰线性范围敏感性各个参数的定义回收率计算方法（以加入的被测物为标准液为例）回收率（%）=（回收浓度/加入浓度）×100%加入浓度=(标准液浓度×标准液体积)/（基础样本体积+标准液体积）回收浓度=样本最终测定浓度-基础样本浓度各个参数的定义回收率对加入不同浓度水平的样本在完成回收实验后，计算平均回收率。理想状态时的回收率为100%误差大的方法其回收率低，

2、准确度较差干扰干扰描述的是除了分析物以外，某些其他成分的影响，或一组成分对分析物测量的准确度的影响。各个参数的定义干扰物质的来源各个参数的定义线性范围分析系统最终输出的、与被测物浓度或活性成比例的、浓度或活性值的范围。分析灵敏度国际理论和应用化学联合会（IUPAC）将方法的分析灵敏度定义为校准曲线的斜率及对于规定量的变化分析程序产生信号的变化。基本上，这一词语定量了相对于分析物量、浓度或特性的变化的信号变化。各个参数的定义分析特异性与准确度相关联，并指的是分析方法只确定分析物,而对其他相关的物质不起作用的能力。各个参数的定义空白测定在测量程序过程中，由于试剂和样本成分

3、而观察到的响应被认为是“空白测量”。通过下列试验可获得这些值：没有样本的试剂溶液—试剂空白；样本溶液和缺少关键试剂的溶液—样本空白各个参数的定义检出限IUPAC将检出限定义为给定分析程序具有适当的确定检出的分析物的最小浓度或量。检出限依赖于空白读数大小，并且被认为与这些测量的精密度有关系。各个参数的定义精密度分析方法对同一样本产生重复测量相同值的能力被称为它的精密度，也被称为随机分析误差。精密度通常由同一材料至少分析20次，并且计算标准差的重复试验来估计。各个参数的定义精密度的分类批内精密度在同一分析批内重复地分析同一样本的差异性，或对一系列的临床标本的同一批内进行双

4、份检测，并计算双份测定的标准差。各个参数的定义批间精密度在同一天内，在几个不同批重复检测同一样本时，可估计日内精密度或批间精密度。各个参数的定义日间精密度在同一实验室，由同一(组)操作员在同一仪器上，使用同一方法和同种、同一批号试剂，在一段时间内（一般为一个月或20个工作日）对同一测定样品（常用质控品）测量结果的精密度。各个参数的定义临床免疫学室内控制CV规定：纳克（ng）级可接受的CV在30%。我们检测的各个项目精密度的CV值应达到最低要求≤30%。各个参数的定义定性实验方法的评价定义仅给出阳性或阴性（是或非）的实验结果。评价要素临界值（cutoff）重复性实验方法

5、比较评价准备操作人员应接受培训，熟悉样本与试剂的处理和保存、正确的实验过程和结果解释及质量控制操作等用于评价实验的临床标本，应按要求采取。必要时，应新鲜采取并尽快完成检测。临界值实验结果处于（阴、阳性）分界点时的样本中分析物浓度值；低于此值，定性实验的结果为阴性；高于此值，定性实验的结果为阳性。定义定性实验来讲，临界值是唯一的医学决定水平。临界值当样本中被测定物浓度处于临界水平时，定性实验重复检查同一样本，将产生50%的阳性结果和50%的阴性结果。当样本浓度在临界值以上增加时，阳性结果比率增加；当样本浓度在临界值以下减低时，阴性结果比率增加。临界值的95%区间当样本浓

6、度高于临界值时，重复实验产生95%阳性结果；当样本浓度低于临界值时，重复实验产生95%阴性结果；之间的样本浓度范围为临界值的95%区间。重复性评价确立方法的临界值；在临界值基础上准备出-20%浓度的样本和+20%浓度的样本；对以上低、高浓度样本分别测定20次，记录阴性及阳性结果数。重复性评价当实验结果表明“临界值”样本的阴性结果和阳性结果不是各占50%时，原因可能是：被评估的临界值浓度不准确；结果数据不充足；方法学剂量反应曲线在临界值处是非线性的。重复性评价当实验结果表明+20%浓度的样本产生阳性结果数≥95%，同时，-20%浓度的样本产生阴性结果数≥95%，说明临界

7、值+20%浓度范围等于或超出临界值的95%区间，对于被测定物浓度在±20%浓度范围以外的样本，实验方法将给出稳定的结果。当阳性和/或阴性结果数<95%时，应另外准备不同浓度的实验样本，重新进行评价。方法学比较样本种类和数量最好使用常规病人的新鲜样本，样本量应保证评价实验方法和比较方法测定的需要。样本中被测物应稳定，应尽可能用评价方法和对比方法同时完成测定。作为最低要求，用对比方法测定的阴性和阳性样本数量，应分别在50例以上。方法比较实验过程使用临床样本进行方法学对比研究应在10到20天内完成。保证足够的样本量；确保对实验方法的评价在常规实验条件下进行