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时间:2018-01-07
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1、表面增强拉曼散射标记免疫检测再生性探究 【摘要】目的:探讨表面增强拉曼散射标记免疫检测技术的循环利用问题和价值。方法:采用4,4’-联吡啶和苯硫酚制备金溶胶作SERS标记分子,并组装抗原抗体复合物,用其进行SERS检测,通过对SERS谱图的分析识别加入的抗原,重点研究固相抗体的重复使用方法。甘氨酸-HCI缓冲体系能彻底分离抗原和抗体,在SERS标记免疫检测中,能通过实验研究该体系对基底再生性和稳定性的影响。结果:使用甘氨酸-HCl缓冲体系对抗原抗体复合物进行洗脱,在洗脱时间为24h时,抗原和抗体能充分分离,因此清除了抗体上的标记免疫溶胶和抗原。第二次制备抗原抗体复合物时,基底的再
2、生能力良好,重复使用的次数可达约10次,同时能继续识别标记分子,并进行SERS检测,具有稳定性。结论:通过甘氨酸-HCI生物缓冲体系洗脱是一种洗脱基底再生效果好和稳定性强的方法。【关键词】表面增强拉曼散射;标记免疫检测;再生性doi:10.3969/j.issn.1674-4985.2013.15.0718拉曼光谱是在分子水平上研究物质结构的一种重要的工具,已广泛应用于分析科学领域[1],表面增强拉曼光谱克服了普通拉曼光谱检测灵敏度低的缺点[2],是灵敏度较高的研究界面效应的技术之一,能最大限度地应用于研究吸附分子在表面的取向及吸附行为、吸附界面表面状态、生物大分子的界面取向及构型
3、、构象和结构分析[3]。在商品化的实际应用中,需要强调产品的可再生利用性,需采用真正可行的抗体抗原分离方式,同时不影响抗体抗原的活性与特异性[4]。在以上理论的基础上,本实验在SERS检测中引入合适的生物洗脱体系——甘氨酸-HCI缓冲体系,以探究本方法的洗脱效果、稳定性和重复使用性。1材料与方法1.1材料用Frens法制备得的金溶胶,粒径大约30~40nm。浓度1mmol/L的苯硫酚和浓度1mmol/L的4,4’-联吡啶分子溶液。3.34mg/L的羊抗人IgG。小牛血清白蛋白(BSA)(5%p)。pH9的硼砂缓冲溶液。美国FullMoonBioSystems公司的生物芯片。TBS/
4、0.1%Tween、TBS和三次水。1.2方法1.2.1制备金溶胶作免疫标记用Frens法制备得到紫红色浑浊的金溶胶,粒径大约30~40nm。将浓度1mmol/L的苯硫酚1μl和浓度1mmol/L的4,4’-联吡啶0.48μl两种标记分子溶液分别加入金溶胶中做标记,同时对标记溶胶进行多次离心,之后重新悬浮,以去掉多出来的标记分子。把3.34mg/L的羊抗人IgG5μl加进标记溶胶中,在室温下充分反应后,对标记溶胶再次离心,使其悬浮。选择5%p的BSA即小牛血清白蛋白把表面的空位进行封闭,然后离心,在硼砂缓冲溶液(pH9)的作用下,再实现溶胶的悬浮。1.2.2制作固相抗体抗体使用的稀
5、释液是硼砂缓冲溶液(pH9),稀释的浓度以每毫升200~500μg为宜,之后把稀释好的液体滴在美国FullMoonBioSystems公司的生物芯片所做的固相基底上,形成拉曼光谱的采集点。环境湿度维持65%~75%,把上面所制作好的芯片放入,12h后拿出,然后放在普通室温中,干燥0.5h。1.2.3组装三明治结构的复合物和进行SERS检测把之前制得的抗体分别在BSA溶液(5%)中、人抗原的缓冲溶液中和标记免疫金溶胶溶液振荡0.5h、2~4h和2h,在每次震荡后分别用三次水以及TBS/0.1%Tween、TBS和三次水依次冲洗,再分别用氮气吹干。制得“固相抗体-待测抗原-标记免疫金溶
6、胶”,它是三明治结构的复合物,可以用该抗体来进行SERS检测。1.2.4仪器使用的仪器与设备有LEO-1530型扫描电子显微镜、法国Jobin8Yvon公司的HR800共聚焦激光拉曼散射仪、He-Ne激光器、电荷耦合检测器和100倍的长焦镜头物镜。1.2.5选择洗脱体系先用人抗原和羊抗人抗体制备抗原和抗体的复合物,第一次选择强酸的盐酸溶液(pH2)进行洗脱,让基底在强酸溶液中震荡,震荡2h,把4,4’-联吡啶作为免疫标记分子,第二次组装三明治结构的复合物,用来进行SERS检测,观察SERS谱图。在看到生物缓冲体系的作用后,采用甘氨酸-HCI(0.2mol/L)生物缓冲体系,调节体系
7、的pH值,使pH为2,再把已制备好三明治夹心结构的基底浸入其中。观察洗脱之前、洗脱5h、洗脱10h、洗脱24h后测得的SEM图。1.2.6洗脱后基底的稳定性选择羊抗人抗体抗原和苯硫酚,把后者作为标记分子,制备抗原抗体复合物。然后再用用甘氨酸-HCI体系对复合物洗脱,分别在暗处放置在10d、1个月、2个月后,第二次制备三明治结构。分析经过静置再次组装的三明治结构SERS谱图。1.2.7观察载体的重复使用性洗脱基底1、5、10次,再分别进行组装,第二次抗原检测以苯硫酚作为
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