原因不明不孕患者植入窗口期血浆sgp190和lif表达研究

《原因不明不孕患者植入窗口期血浆sgp190和lif表达研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、原因不明不孕患者植入窗口期血浆sgp190和LIF表达研究　　【摘要】本文目的在于对原因不明不孕患者植入窗口期血浆sgp190和LIF表达进行分析，以了解其对妊娠建立的可能影响。本文成功地建立了血sgp190双抗体夹心ELISA测定法。原因不明不孕患者植入窗口期血浆sgp190与LIF浓度表达异常，sgp190可能对人体整个循环中LIF表达具有负调节作用，从而影响胚泡着床而造成不孕。【关键词】白血病抑制因子；可溶性gp190；酶联免疫吸附实验；胚泡着床1材料和方法1.1材料1.1.1实验材料LIFELISA检测试剂盒（R&DSystems）

2、、抗gp190胞外区抗体由晶美公司提供。抗sgp190多克隆抗体、sgp190亲和纯化品由本研究室制备[1]。1.1.2研究对象实验组：17例不明原因原发不孕症患者来源于重庆医科大学附属第一医院，平均年龄28.6士3.7年，不孕年限3～10年，平均3.56士0.89年。4纳入标准：年龄≦35岁，不孕年限>3年，月经周期28～30天，基础体温双相，高温相≥12天，分泌中期血孕酮≥32nmol/L，血PRL正常，基础内分泌正常，夫妇双方染色体核型正常，抗精子抗体阴性，宫腔镜检查子宫正常，腹腔镜检查为正常盆腔，子宫、输卵管外观正常，6个月内未用过

3、激素类药物，男方精液检查正常。对照组：19例，平均年龄27.7士4.8年，纳入标准：除继往有正常生育史外，其它同实验组。试验得到受试者知情同意。1.2方法1.2.1双抗体夹心sgp190ELISA检测的建立及方法学鉴定1.2.1.1HRP标记抗体的制备：见文献常规方法，用改良碘酸钠法标记亲和层析纯化抗sgp190多克隆抗体。1.2.1.2双抗体夹心ELISA法的建立与双抗体工作浓度的确定（采用方阵滴定法）以包被缓冲液稀释抗gp190胞外区部分McAb至浓度为1、2、4、6μg/ml，分别在酶标板上进行包被过夜。洗涤3次。在各孔中加入封闭液，

4、37℃保温2h，洗涤3次。在各孔中分别加入gp190抗原液5μg/ml，37℃保温2h，洗涤3次。加入系列稀释的酶标抗体兔抗人sgp190（稀释度为1：500-1：3000）100?l，37℃下孵育lh，洗涤5次。在各孔中加入HRP-羊抗兔IgG抗体，1/10000稀释，100μl/4孔，37℃保温1h，洗涤6次。加底物显色。加2mol/LH2SO4终止反应后，读取OD450nm值。以OD450nm值为1左右的条件作最佳条件，以此选择包被抗体和酶标抗体的工作浓度。1.2.1.3建立标准曲线以确定浓度的抗人sgp190McAb包被酶标板，加稀

5、释的标准抗原0.5-100ng/ml（10?g/ml的标准抗原4?l，加396?l稀释液成100ng/ml，然后倍比稀释成0.5-50ng/ml）。不同浓度的标准品都设四个平行测定孔，37℃1h，洗3次；加入稀释的兔抗人sgp190抗体100μl/孔，37℃1h，洗3次；加入确定稀释度的HRP-羊抗兔IgG抗体100μl/孔，37℃1h，洗3次；加底物溶液100μl/孔。37℃避光反应10～15min，2mol/LH2SO4终止反应，酶标仪450nm处读取OD值。以标准抗原（ng/ml）为横坐标，相应OD值为纵坐标绘制标准曲线。1.2.1.

6、4检测方法准确性分析（回收实验，Recoveryassay）在已知sgp190浓度的血浆中加入不同浓度的sgp190标准液，用已建立的ELISA方法测回收率。1.2.1.5检测方法精确度分析取3份血浆标本，做批内和批间测定，计算CV，分析制备sgp190ELISA检测方法的精确度。41.2.1.6健康女性与原因不明不孕患者植入窗口期（月经周期第19～21d）血浆sgp190浓度测定按上述标准曲线，利用建立的ELISA法测定健康女性与不孕患者植入窗口期血浆中sgp190浓度，每个样本作2个复孔。1.2.2健康女性与原因不明不孕患者植入窗口期（

7、月经周期的第19～21天）血浆LIF浓度测定LIFELISA检测试剂盒灵敏度8pg/ml，批内CV　　2.3sgp190ELISA检测方法准确性分析在已知sgp190浓度的血浆中加入不同浓度的sgp190标准液，用已建立的ELISA方法测得的回收率分别为95%、84%和87%，平均为88.67%。2.4sgp190ELISA检测精确度分析取3份血浆标本，做批内和批间精确度分析。结果显示，批内平均CV为7.6%，批间平均CV为12.37%。2.5LIF与sgp190检测结果用ELISA方法分别测定健康能育女性与原因不明不孕患者植入窗口期血浆s

8、gp190与LIF浓度（结果见图2、3），健康对照组（169±27pg/ml）血浆LIF浓度明显高于不孕患者组（123±18pg/ml）（P4