最新药学院实验四：线粒体及细胞核的制备及观察课件PPT.ppt

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1、药学院实验四：线粒体及细胞核的制备及观察二、实验原理线粒体是真核细胞特有的进行能量转换的重要细胞器。将动植物组织制成匀浆，在适当的悬浮介质中差速离心法可以分离细胞线粒体。在一定的离心场中（选用离心机的一定转速），球形颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的粘度。在一均匀的悬浮介质中离心一定时间，组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同将停留在高低不同的位置。依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。细胞器沉降先后顺序是细胞核、线粒体、溶酶体和其他微体、核糖体和大分子。差速离

2、心技术：利用细胞核与线粒体在一定介质中的沉降速度的差异，可采取分级差速离心的方法，将细胞核与线粒体逐级分离出来。悬浮介质通常采用缓冲的蔗糖溶液，它较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性；pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易聚集成团，有利于分离。整个操作过程样品要保持在0℃-4℃，避免酶失活。3.试剂：(1)0.25mol/L蔗糖-0.01mol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)-盐酸缓冲液(pH7.4)(2) 1%詹纳斯绿B(JanusgreenB)染液。(3) 姬姆萨染液（Giemsa）。(4) 1/15mol

3、/L磷酸缓冲液（pH6.8）(5) 卡诺（Cornay）固定液。(6)生理盐水四、实验步骤(一)兔肝细胞线粒体及细胞核的分离（动物材料）1.制备肝细胞匀浆：实验前将白兔空腹12小时，脱臼处死，剖腹取肝，迅速用生理盐水洗净血水，用滤纸吸干水，称取肝组织0.3g，剪碎；用预冷的0.25mol/L蔗糖溶液洗涤数次。然后加1.5ml预冷的0.25mol/L蔗糖溶液，分数次添加蔗糖溶液，冰浴中用玻璃匀浆器将肝制成匀浆，肝匀浆用双层纱布过滤(滤液制两张涂片①②).涂片过程：3.分离物鉴定：（1） 细胞核：将涂片①③（不加盖玻片）自然干燥后加入Carn

4、oy固定液15min，晾干。Giemsa染液染10min，蒸馏水漂洗数秒，用滤纸吸干水，用显微镜（40×）检查，细胞核呈紫红色，混杂的细胞质为浅蓝色碎片。（2）线粒体：取线粒体沉淀滴在载玻片上，得涂片②④，勿太密。滴加1-2滴1%詹纳斯绿B溶液染色，10分钟后加盖玻片，吸水纸吸走多余染料，用光学显微镜观察，线粒体呈蓝绿色，小棒状或哑铃状。(二)玉米线粒体及细胞核的分离（植物材料）从植物细胞分离线粒体，除了作线粒体功能研究外，在植物细胞遗传工程中，常用于分离核外基因――线粒体DNA等目的。分离线粒体的方法仍采用均匀介质中的差数离心。介质中0

5、.25mol/L蔗糖也可以用0.3mol/L甘露醇代替。EDTA螯合二价阳离子，Ca2+除去后细胞间粘着解体，促使组织分散成单个细胞。牛血清白蛋白（BSA）能包在细胞外面，并作为竞争性底物削弱蛋白酶的作用。1.试剂1）分离介质：0.25mol/L蔗糖，50mmol/L的Tris-HCl缓冲液（pH7.4），3mmol/LEDTA，0.75mg/mlBSA。2）保存液：0.3mol/L甘露醇（pH7.4）。3）20%NaClO溶液。4）1%詹纳斯绿B染液，用生理盐水配制。2.器材剪刀，漏斗，研钵，纱布，离心管，显微镜，冷冻高速离心机等。3.

6、实验方法1）剪取1～2cm长的幼苗黄化苗0.5g，剪碎；加2.0ml预冷的分离介质，冰浴上研磨成匀浆。2）匀浆用双层纱布过滤(滤液制两张涂片①).3）滤液700g离心10分钟，除去核和杂质沉淀。4）上清夜10000g离心15分钟，沉淀为线粒体制涂片②5）涂片①②未干时，立即滴加1%詹纳斯绿B染液，染色10分钟，盖上盖玻片，用显微镜观察，线粒体是蓝绿色圆形颗粒。五、实验结果光学显微镜观察，线粒体呈蓝绿色，小棒状或哑铃状。六、实验报告1.分别描述2张细胞核涂片的结果(如平均每个视野中所见完整的细胞核数量，完整的细胞或带有残留细胞质的细胞核的约

7、占多少等)2.分别描述鼠和水稻黄化苗的两张线粒体装片的观察结果,根据你的实验结果,你认为所分离的线粒体的纯度如何?3.绘图：动物材料涂片③④，植物材料涂片①②，并比较动物和植物线粒体的差异。从拔罐的误区说拔罐误区“拔罐会伤阳气”，“拔罐不能经常拔，拔多了会伤人，致气虚”，“拔罐只祛湿”------更正的现实意义和重要性这一误区或错误观点很普遍。是因了解或知道拔罐真知和本原的太少，有必要转变。养生保健重要性决定了拔罐使用的普遍性。需要普及。医务工作者都须明了拔罐的实质，不能陷入这种误区，不能信口开河、断章取义误导患者。有责任和义务把科学知识

8、传播给患者。中医基础理论中医拔罐技术离不开中医的基础理论指导，尤其是经络学说理论的指导。拔罐法（或拔罐学）是中医治疗学的一个重要组成部分，其概念是指用排除罐、筒或杯内空气以产生负压，使其吸附于