实验六细胞核和线粒体荧光观察.ppt

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1、实验六细胞核和线粒体的荧光观察一、实验目的学习荧光显微镜的工作原理及使用方法了解荧光探针Rhodamine123和Hoechst33342与细胞成分的结合特性和光谱特性二、实验原理1.荧光显微镜细胞参量荧光探针吸收/发射nm特性DNA和RNAPropidumiodide(PI)535/617红色荧光嵌入核酸双链间,只能标记死细胞.用于染色体,细胞观察,分辨死活细胞和细胞周期研究Ethidiumbromide(EB)518/605红色荧光嵌入核酸双链间,只能标记死细胞.用于电泳分析,染色体观察DAPI358/461蓝色荧光半通透细胞,结合于DNA的AT碱基对.用于细胞周期的研究,染色体和

2、细胞核的观察Hoechst33342350/461蓝色荧光结合于DNA的AT碱基对,可进入活细胞,用于细胞周期的研究,染色体和细胞核的观察蛋白和抗体的耦联探针FITC494/518绿色荧光染死细胞,对PH值变化不敏感Texasred595/615红色荧光多参量细胞标记溶酶体Neutralred541/640红色荧光探针微偏碱性,可标记溶酶体等酸性细胞器线粒体Rhodamine123507/529黄绿色荧光可进入活细胞,阳离子性,摄入快,淬灭快,无毒性常用荧光探针介绍Hoechst33342和Rhodamine123Ho.33342是一种亲脂性物质，能与DNA特异性结合的荧光探针，所以被

3、大量用于活细胞的观察和定量的研究。荧光激发和发射特性分别为350nm和461nm。罗丹明123是一种亲脂性的阳离子荧光探针。用它来标记线粒体是由于线粒体的基质对于膜间隙具有负电荷，而罗丹明123具有正电荷，二者电性相吸。所以能较好地观察线粒体的形态变化。荧光激发和发射特性为507nm和529nm。三、仪器、材料与试剂仪器荧光显微镜，倒置显微镜材料A549、WI-38pc-3、载玻片，盖片，滴管，滤纸试剂PBS缓冲液pH7.4Ho.33342储存液:1mg/mL(溶于PBS)罗丹明123储存液:1mg/mL(溶于甲醇)四、实验步骤1.将肿瘤细胞和正常组织细胞培养到小盖玻片上2.配制Ho.

4、33342和罗丹明123工作液:Ho.33342(10μg/mL),罗丹明123(10μg/mL)（溶于PBS缓冲液，pH7.4）3.将盖玻片上的细胞用PBS缓冲液轻轻漂洗2次4.在parafilm膜上分别滴加Ho.33342和罗丹明123工作液各10L，将盖玻片上的细胞倒扣在parafilm膜上室温暗处孵育10min。5.在parafilm膜上加PBS缓冲液，待盖玻片被冲起后，再轻轻揭下盖玻片,用PBS缓冲液轻轻漂洗2次。6.利用荧光显微镜观察细胞核、线粒体。配制Ho.33342和罗丹明123工作液:Ho.33342(10μg/mL),罗丹明123(10μg/mL)（溶于PBS缓冲

5、液，pH7.4）将盖玻片上的细胞用PBS缓冲液轻轻漂洗2次，分别滴加Ho.33342和罗丹明123工作液各10L，室温暗处孵育10min用PBS缓冲液轻轻漂洗2次，放在载玻片上制成的小室上利用荧光显微镜观察细胞核、线粒体实验步骤将肿瘤细胞和正常组织细胞培养到小盖玻片上,至细胞进入对数生长期思考题1.荧光显微镜的工作原理，及使用时应注意的问题。2.细胞核的形态的变化与功能的关系