最新第二讲-基因工程制药-新版2教学讲义PPT.ppt

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1、第二讲-基因工程制药-新版2血红蛋白基因血红蛋白基因排列顺序血红蛋白的结构血红蛋白的运送氧气功能血红蛋白的基因工程流程一、工具酶的分离纯化（一）基因工程制药所用到的工具酶（二）关于限制酶（三）关于连接酶R/M体系：是由两种酶活性配合完成的：一种是修饰的甲基转移酶另一种是核酸内切限制酶E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶※当λ(k)噬菌体侵染E.coliB时，由于其DNA中有EcoB核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中虽然也存在这种特异序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷

2、甲硫氨酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。※EcoB(大肠杆菌B株)的核酸酶不能识别已甲基化的序列。R/M体系的作用：保护自身的DNA不受限制；破坏外源DNA使之迅速降解TGAN8TGCTACTN8ACGATGAN8TGCTACTN8ACGAECOB核酸酶甲基化酶CH3CH3CH3CH3噬菌体来源序列宿主来源序列※限制性内切酶本是微生物细胞中用于专门水解外源ＤＮＡ的一类酶，其功能是避免外源ＤＮＡ的干扰或噬菌体的感染，是细胞中的一种防御机制。※由于R/M现象的发现使得核酸内切酶成为基因工程重要的工具

3、酶。2、限制酶的定义凡是能够识别和切割DNA分子内特定核苷酸顺序的酶称为限制酶。限制酶分为三个类型：（1）Ⅰ型限制酶-----由于其切点不固定，很难形成特异性的切割末端。（2）Ⅱ型限制酶-----是位点特异性酶，是基因工程理想的工具酶。（3）Ⅲ型限制酶-----对DNA的识别与切割点不同，不产生特异性DNA片段。3、限制酶的特征具有专一性的识别位点。能够形成固定的核苷酸单链末端。比较适合于进行DNA结构的分析和进行基因重组。4、限制酶的作用（1）进行DNA重组。（2）构建新载体。（3）构建基因文库。（4）进行DNA序列分析

4、。（5）制备DNA放射性探针。5、基因工程所用到的限制酶通常是Ⅱ型限制酶，具体有以下几种。EcoR-IHind-IIIBamH-IPst-ISst-ISal-IAva-IBcl-IHind-IIHpa-IBgl-IICla-IHae-IIIHha-IHinf-IHpa-IIMbo-ISma-IXba-IXho-I6、影响限制酶作用的因素（1）DNA的纯度（2）DNA的甲基化程度（3）DNA的结构（4）反应的温度----最适温度为37度（5）反应的缓冲体系----反应体系中通常含有MgCl2、NaCl、KCl、β-巯基乙醇、

5、二硫苏糖醇、牛血清白蛋白。它们具有激活酶、稳定酶的作用。（三）关于连接酶1、定义----凡是能够催化DNA片段5’-末端的磷酰基与3’-末端的羟基结合成磷酸二酯键的酶，称为连接酶。2、作用----主要用于（1）正常DNA的合成。（2）损伤DNA的修复。3、种类（1）DNA-连接酶----广泛存在于生物细胞之中，主要取自于大肠杆菌E.coli。（2）T4-DNA连接酶----来自于经过T4-噬菌体感染的大肠杆菌E.coli。（3T4-RNA连接酶----催化单链DNA或RNA的5‘磷酸与另一单链DNA或RNA的3’羟

6、基之间形成共价连接。二、基因工程载体的分离纯化（一）定义（二）基因工程载体的必备条件（三）基因工程载体的种类（一）定义能够将目的基因携带进宿主细胞、并可使得目的基因能够在宿主体内进行自主性复制的遗传因子，称为基因工程载体。（二）基因工程载体的必备条件（1）具有有效运载能力。（2）载体自身能够独立复制，并且在宿主体内进行自主性复制。（3）载体在携带目的基因之后，还能够在宿主体内进行自主性复制。（4）在宿主体内，能够控制外源基因的表达活动。（5）能够携带大小不同的外源性目的基因。（6）鉴定方便、装卸技术简单。（7）

7、容易控制、安全可靠。（8）应具有灵活的克隆位点、并且有方便的筛选标记。（9）应具有很强的启动子。（10）应具有阻遏子，使启动子受到控制，因为外源基因的高效表达会抑制宿主细胞的生长、增殖，而阻遏子可使宿主细胞免受这种影响。（11）应具有很强的终止子，以便重点克隆外源基因区段，而不转录其它无关基因。（12）所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号，即含有起始密码AUG和SD序列，以便转录之后能够顺利于进行翻译。（三）基因工程载体的种类1、细菌质粒2、真核基因病毒DNA3、λ噬菌体DNA4、单链DNA噬菌体M13载体5、人

8、工质粒载体----科斯质粒6、酵母人工染色体7、其他载体1、细菌质粒（1）质粒的定义（2）质粒的特性（3）质粒的分类（4）质粒载体的具备条件（5）常用的细菌质粒（1）质粒的定义存在于天然细菌体内的一种独立于细菌染色体之外的双链环状DNA，具有独立复制的能力，常带有细菌的抗药基因。也存在于某些真核细胞（酵