地奥心血康对培养h9c2心肌细胞缺氧-复氧损伤保护机制

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1、地奥心血康对培养H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤保护机制　　心肌缺血再灌注损伤是近年来的研究热点，中药在保护心肌缺血再灌注损伤作用机制的研究进展较快。我国药典2010年版收入的地奥心血康是薯蓣科植物黄山药、穿龙薯蓣的根茎提取物。研究表明，其具有活血化瘀、行气止痛、宣痹通阳、补益气血等功能，以其为原料的地奥心血康（软）胶囊广泛应用于缺血性心脏病的治疗。材料与方法实验药物地奥心血康，浅棕黄色粉末，含甾体总皂苷≥35%，由地奥集团学术部提供。实验前用PBS液配制成所需浓度溶液使用。实验对象H9e2大鼠心肌细胞株，购自中国医学科学院基础医学研究院基础医学细胞中心。

2、试剂DMEM高糖培养基，胎牛血清，MTT（中奥天元公司），罗丹明123染色试剂盒（凯基公司），LDH、SOD、MDk检测试剂盒（南京建成生物工程公司）。仪器CO2培养箱（ThermoElectronCorporation），荧光倒置显微镜（OlympusOpticalCo.Ltd.JAPAN），酶标仪（BIORAD），分光光度计（vIS-7220）。4方法H9c2心肌细胞的培养H9c2细胞株在含10%胎牛血清的DMEM高糖完全培养基中培养（条件为37℃，5%CO2），待细胞生长80%满时，进行细胞传代，2—3天传代1次。实验分组实验分为5组：正常对照组（

3、C组），缺氧/复氧模型组（H/R组），缺氧/复氧模型+地奥心血康（DAXXK）低齐量、中、高剂量（10m#L、20mg/L、40mg/L）干预组（H/R+L、M、H组）。缺氧/复氧模型建立实验时按一定量细胞密度接种于细胞培养多孔板。待细胞完全贴壁后，弃去细胞上清液，每孔加入一定量的缺氧液（137mMNaCl，12mMKCI，0.49mMMgCh2，0.9mMCaCl2H2O，4mMHEPES，20mMNalactate[pH6.2]）燃后将细胞培养多孔板置入37℃、含95%N2+5%CO2持续通气的缺氧密闭容器中3小时即为缺氧。弃去缺氧液再换等量复氧液，

4、即含10%胎牛血清的DMEM高糖完全培养基，并将细胞培养多孔板置人37℃、含5%CO2的普通培养箱继续培养2.5小时即为复氧。C组在试验开始时更换新的完全培养基。H/R+L、M、H3组先进行缺氧处理，进行复氧的同时给药，并使各组药物终浓度分别为10ms/L、20ms/L、40mg/L。检测结果采用MIT比色法检测（设不加细胞只加孵育液为空白组）测定H9c2心肌细胞存活率，并测定H9c2心肌细胞线粒体膜电位（△m）、LDH活性、SOD活性检测、MDA含量。4结果地奥心血康对H9c2心肌细胞存活率及LDH活性的影响与H/R组比较，C组心肌细胞存活率及LDH活

5、性差异具有统计学意义，地奥心血康干预的3组H/R+L、M、H/R+H组，可明显升高心肌细胞存活率，降低上清液中LDH活性，差异有统计学意义。且心肌细胞存活率测定结果中H/R+L、M组与H/R+H组间有统计学差异，LDH活性测定结果中3个用药组间有统计学差异。说明地奥心血康可有效保护缺氧/复氧对H9e2心肌细胞的损伤，且具有一定的剂量依赖性，随着剂量的升高，保护作用更加明显。地奥心血康对H9c2心肌细胞SOD活性及MDA含量的影响与H/R组比较，c组心肌细胞上清液中SOD活性及MDA含量差异具有高度统计学意义，地奥心血康干预的3组细胞上清中的SOD活性明显

6、升高且MDA的含量明显下降，均具有统计学差异。且SOD活性测定结果中H/R+L与H/R+M、H/R+H组间有统计学差异，MDA含量测定结果中3个用药组间均有统计学差异。说明地奥心血康可保护缺氧，复氧损伤H9c2心肌细胞的氧化损伤，且具有一定的剂量依赖性，随着剂量的升高，保护作用更加明显。4地奥心血康对H9c2心肌细胞线粒体膜电位的影响本实验检测结果显示，H/R组在荧光显微镜下发出强黄绿色荧光，而C组及H/R+L、H/R+H组荧光信号均较弱，说明地奥心血康可有效提高缺氧/复氧损伤H9c2心肌细胞的线粒体膜电位。讨论近年来，中药减轻心肌缺血再灌注损伤的实验研

7、究取得了较大进展。地奥心血康在保护心肌缺血再灌注损伤方面的作用机制较为广泛。心肌细胞释放LDH量的多少常被作为一个细胞不可逆损伤或坏死程度大小的标准。本实验结果表明，地奥心血康可以降低缺氧/复氧损伤后H9e2心肌细胞LDH的释放量，明显提高心肌细胞存活率，有效保护心肌细胞。线粒体膜电位（Δm）反映了线粒体内膜的结构情况，心肌细胞缺氧/复氧损伤之后，线粒体△m下降，表明细胞内膜结构发生改变，膜通透性增加。本研究结果显示，地奥心血康可以有效提高缺氧复氧损伤后H9c2心肌细胞线粒体膜电位，保护细胞线粒体膜。在缺血/再灌注损伤的发病机制中，自由基损伤起着关键性作

8、用。4