最新浅谈乙肝病毒检测教学讲义ppt课件.ppt

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1、浅谈乙肝病毒检测病毒鉴定方法一、分离培养方法二、快速诊断方法1、光学显微镜检查病毒包涵体及某些大病毒颗粒的检查2、电子显微镜的检查电镜直接检查免疫电镜检查3、血清学检查4、病毒基因组检查核酸杂交和聚合酶链反应乙肝病毒检测一、乙肝五项（两对半）二、乙肝病毒核酸定量检测二、乙肝病毒核酸定量检测1.检测原理利用荧光PCR技术，以HBV基因组中相对保守区为靶区域，设计特异引物及荧光探针，通过PCR对DNA进行快速定量检测。荧光探针TaqMan探针实时荧光PCR技术。在PCR反应过程中，同时利用Taq酶的5’→3’聚合酶活性和核酸外切酶活性，使得TaqMan探

2、针降解，荧光报告基团和淬灭基团分离使得荧光信号发射，FAM荧光检测乙型肝炎病毒JOE/RED610nm波长通道检测内参。PCR分四个阶段如何定量？Ct值的概念Ct值的定义是PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的阈值所对应的循环次数。定量原理确定初始模板的浓度初始DNA量越多,荧光达到某一值（域值）时所需要的循环数越少Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量荧光化学SYBRGreen1TaqManTaqManSYBRGreenI工作原理。SYBRGreen1结合到双链DNA的小沟部位SYBR

3、Green1染料只有和双链DNA结合后才发荧光GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAAGTTTTTTGGGGCCCCCCCCAAAAATACCGGGGTTACGAACGGTAAT未结合SYBRGreen1dye变性:无荧光信号2.所用试剂组分名称规格数量主要成分核酸提取试剂DNA提取液I4.5ml/瓶2DNA提取液质控品及阳性定量参考品阴性质控品250ul/管1HBV阴性血清强阳性质控品250ul/管1灭活HBV阳性血清临界阳性质控品250ul/管1灭活HBV阳性血清HBV定量参考品（2.0X106IU/ml）250u

4、l/管1灭活HBV阳性血清HBV定量参考品（2.0X105IU/ml）250ul/管1灭活HBV阳性血清HBV定量参考品（2.0X104IU/ml）250ul/管1灭活HBV阳性血清HBV定量参考品（2.0X103IU/ml）250ul/管1灭活HBV阳性血清PCR检测试剂HBV-内标溶液100ul/管1内标质粒及稳定剂HBV-PCR反应管1人一份/管20引物、探针、taq酶等3、实验步骤1.DNA提取将待测样本、阳性定量参考品、阴性质控品、HBV强阳性质控品、HBV临界质控品进行同步处理。1.1取200μL样品，加入450μLDNA提取液I和4μL

5、内标溶液，用振荡器剧烈震荡摇匀15秒，瞬时离心数秒，100℃处理10分钟1.212000rpm离心5分钟，备用2.PCR试剂准备直接使用HBV-PCR反应管3.加样HBV-PCR反应管分别加入将待测样本、阳性定量参考品、阴性质控品、HBV强阳性质控品、HBV临界质控品上清20μL。盖紧管盖，8000rpm离心数秒后扩增4.PCR扩增对各标本进行标记反应条件：93℃2分钟93℃45秒→55℃60秒→10个循环93℃30秒→45℃60秒→30个循环FAM通道检测HBV核酸，VIC通道检测内标4.结果判定1如果在FAM检测通道检测扩增曲线无明显对数期或Ct

6、值等于30，VIC检测通道扩增曲线有明显对数期，则为阴性或小于检测灵敏度2FAM检测通道扩增曲线有明显对数期且Ct值小于30按以下方法判断：C<100,HBVDNA浓度<100IU/ml100≤C≤5.0E+008,HBVDNA浓度=CIU/mlC>5.0E+008,HBVDNA浓度>5.0X108IU/ml如需精确定量结果，可将样品用阴性质控品稀释到线性范围后再检测，则样品HBVDNA浓度=（CX稀释倍数）IU/ml5.注意事项1每次实验需检测阴性质控品、HBV强阳性质控品、HBV临界质控品，满足要求方可进行判定（阳性质控品Ct<30，阴性质控品无

7、明显对数期或Ct值等于30VIC检测通道扩增曲线有明显对数期）2本试剂盒的最低检出浓度为30IU/ml，最低定量浓度为100IU/ml3所有样品包括质控品均按传染性标本对待严格遵循无菌操作（带口罩手套），所有操作在生物安全柜内操作，物品不能随意带出生物安全柜，用完的物品集中放置高压灭菌后方可处置。一、乙肝病毒e抗原检测1.检测原理在微孔板上预包被鼠抗-Hbe单克隆抗体（HbeAb），配以辣根过氧化物酶标鼠抗-Hbe单克隆抗体（HbeAb-HRP）及TMB（四甲基联苯胺）等试剂，采用双抗夹心法检测血清中的乙肝病毒e抗原（HbeAg）2.所用试剂组成成分

8、规格组成成分规格1.HbeAg微孔板（包被鼠抗-Hbe单克隆抗体（HbeAb））96TX块7.底物B（过氧化