最新实验三 单核苷酸多态性的检测教学讲义ppt.ppt

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1、实验三单核苷酸多态性的检测二.实验原理1.SNPs的概念单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphism,SNPs）是指在基因组水平上由于单个核苷酸位置上存在转换、颠换、插入、缺失等变异所引起的DNA序列多态性。在一个群体中，当基因组内特定核苷酸位置上存在两种不同核苷酸且出现频率大于1％（也有人提出2％）时，被视作SNP。由于这种界标数目极多，覆盖密度大，由此可以大大提高基因组作图和基因定位的精度。2.单核苷酸多态性检测与分析变性高效液相色谱(DHPLC)：高效、快速、高

2、灵敏度、低成本、全自动化操作基于凝胶电泳的限制性片段长度多态性（RFLP）等位基因特异的寡核苷酸杂交（ASO）单链构象多态性（SSCP）分析以荧光共振能量传递为基础的Taqman法DNA芯片、质谱法、微测序法等。CEL1酶（环球基因公司，Transgenomics,Inc.)能识别单碱基错配，也被应用于SNP的检测。4.本实验原理本实验利用聚丙烯酰胺电泳，观察拟南芥不同生态型中某基因片段的SNP。根据测序结果，拟南芥不同生态型Ws和Col的At5g62130片段分子量大小相同，但存在单一位点的差

3、异，而这种差异用常规的琼脂糖凝胶电泳无法区分。在实验中，首先利用PCR扩增拟南芥At5g62130片段基因。然后对PCR产物进行变性和复性后，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。由于SNPs的存在，Ws、Col及Ws和Col杂交F1代中At5g62130扩增片段经变性和复性后，因其构象不同，故可根据其泳动速率的差异而加以区分。Fig. Typicalbandpatternsofduplexanalysismarkersofdifferentloci.Generationofco-dominantPCR-

4、basedmarkersbyduplexanalysisonhighresolutiongelsThePlantJournal1998,16(1):117三、实验材料与试剂1．拟南芥小苗：C0，Ws；2．CTAB提取缓冲液：100mMTris-Cl(pH8.0),20mMEDTA(pH8.0),1.4MNaCl,2%(w/v)CTAB3．氯仿、异丙醇、75％乙醇，无菌水等；4．PCR引物、PCR反应试剂，包括PCRbuffer、dNTP、Taq酶等。5．14％聚丙烯酰胺凝胶、DNA上样缓冲液、D

5、NA分子量Marker、TBE电泳缓冲液、EB染色液等。四实验步骤采用CTAB法提取不同生态型（C0、WS）拟南芥基因组DNA。1）取1~2株小苗，加入50l预热CTAB提取液，在离心管中用玻棒磨成匀浆，再加入350lCTAB溶液，继续研磨。65ºC水浴0.5hr。2）冷却至室温后加入等体积氯仿400l，上下颠倒混匀，12000rpm，离心10min。吸取上清，移入另一管中。3）加入1ml预冷的无水乙醇，混匀后-20ºC放置15min。12000rpm，离心15min。4）倒去上清，沉淀用

6、1ml75％乙醇清洗，略离心后，小心倒去上清，将沉淀空干。5）用20lH2O或TE缓冲液溶解沉淀。2.PCR扩增拟南芥基因At5g62130片段。试剂加样量引物（10M）0.5l0.5lPCRbuffer2ldNTP(25mM)2lTaq0.2lddH2O13.8l模板1l共计20l模板为拟南芥不同生态型C0或Ws小苗的基因组DNA1lPCR反应程序：PCR产物长度为1057bp 。3．PCR产物的变性和复性:1.取PCR产物10l（Co）+10l（Ws），94ºC变

7、性5min，42ºC复性30min。2.14％聚丙烯酰胺电泳，200V，1hr，电泳缓冲液为0.5×TBE。3.电泳完毕后，凝胶用0.5g/mlEB的TBE溶液进行染色15min，在紫外灯下观察条带。4.拍摄电泳结果，标明每个泳道的样品，简要说明形成这些条带差异的原因。5.思考题：简述SNP检测在反向遗传学研究中的应用。1057bp食管癌诊治进展：2014定义食管癌规范化诊治指南，卫生部，2011（适用于地市级、县级）食管癌—下咽到食管胃结合部之间食管上皮来源的癌。早期食管癌—局限于食管粘膜和

8、粘膜下层的肿瘤，不伴淋巴结转移，包括原位癌、粘膜内癌和粘膜下癌。Barrett食管—食管下段的复层鳞状上皮被单层柱状上皮所代替。癌前疾病—慢性食管炎、Barrett食管炎、食管白斑症、食管憩室、食管失弛缓症、返流性食管炎和食管良性狭窄。癌前病变—鳞状上皮不典型增生，包括轻度、中度和重度不典型增生。食管小细胞癌：特殊生物学行为、组织来源及治疗方法等不同于食管鳞癌、腺癌。与肺小细胞癌相似：恶性程度高、早期发生转移、预后差，长期生存率低。约一半的患者在就诊时已有远处转移，尸检发现肝脏转移率高达90％，