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1、单核苷酸多态性snp检测技术SNP的概念单核苷酸多态性(SingleNucleotidePolymorphism，SNP)，指由于单个核苷酸碱基的改变而导致的核酸序列的多态性。在不同个体的同一条染色体或同一位点的核苷酸序列中，绝大多数核苷酸序列一致而只有一个碱基不同的现象，即SNP。它包括单碱基的转换,颠换、插入及缺失等形式SNP在基因组内的形式:一是遍布于基因组的大量单碱基变异;二是分布在基因编码区(codingregion),称其为cSNP，属功能性突变。SNP在单个基因或整个基因组的分布是不均匀的：（1）非转录序列要多于转录序列（2）在转录区非同义突变的频率,
2、比其他方式突变的频率低得多。PCR-RFLP方法原理：利用限制性内切酶的酶切位点的特异性，用两种或两种以上的限制性内切酶作用于同一DNA片断，如果存在SNP位点，酶切片断的长度和数量则会出现差异，根据电泳的结果就可以判断是否SNP位点。特点：该技术应用的前提是SNP的位点必须含有该限制内切酶的识别位点，它是SNP筛查中最经典的方法之一.PCR-RFLP原理图单链构象多态性(SSCP)原理：单链DNA在中性条件下会形成二级结构，不同的二级结构在电泳中会出现不同的迁移率。这种二级结构依赖于碱基的组成，单个碱基的改变也会影响其构象，最终会导致在凝胶上迁移速度的改变。在非变
3、性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链DNA和RNA分子依其单碱基序列的不同而形成不同的构象，这样在凝胶上的迁移速率不同，出现不同的条带，检测SNP。特点：由于该方法简单快速，因而被广泛运用于未知基因突变的检测。这种方法的弊端在于不能确定突变类型和具体位置。变性梯度凝胶电泳（DGGE）原理：是利用长度相同的双链DNA片段解链温度不同的原理,通过梯度变性胶将DNA片段分开的电泳技术。电泳开始时,DNA在胶中的迁移速率仅与分子大小有关,而一旦DNA泳动到某一点时,即到达该DNA变性浓度位置时,使得DNA双链开始分开,从而大大降低了迁移速率。当迁移阻力与电场力平衡时,DNA片段在凝
4、胶中基本停止迁移。由于不同的DNA片段的碱基组成有差异,使得其变性条件产生差异,从而在凝胶上形成不同的条带。等位基因特异PCR(AS-PCR)原理：根据SNP位点设计特异引物,其中一条链(特异链)的3′末端与SNP位点的碱基互补(或相同),另一条链(普通链)按常规方法进行设计,因此,AS-PCR技术是一种基于SNP的PCR标记。因为特异引物在一种基因型中有扩增产物,在另一种基因型中没有扩增产物,用凝胶电泳就能够很容易地分辨出扩增产物的有无,从而确定基因型的SNP。SNPs高通量的检测方法另一大类检测方法是近些年来发展起来的,高通量、自动化程度较高的检测SNPs的方法
5、,较为常用的有:1.DNA测序法;2.DNA芯片检测;3.飞行质谱仪(MALDI-TOFMS)检测;4.变性高效液相色谱(DHPLC)法等等DNA测序法直接测序是最容易实施的SNP检测方法。原理:通过对不同个体同一基因或基因片段进行测序和序列比较,以确定所研究的碱基是否变异,其检出率可达100%。特点：可以得到SNP的类型及其准确位置等SNP分型所需要的重要参数。基因芯片技术(Genechips)原理:是将具有特定碱基序列的探针固定在特殊的载体上，待测基因经提取、荧光标记后，与固定好的探针进行杂交，最后根据荧光的强度和种类测出待测序列的碱基类别。特点：基因芯片具有信
6、息量大和自动化程度高的突出优点。但它也存在若干问题:芯片造价高昂,所需设备贵重,不利于普及应用。MALDI-TOF原理：是将变性的单链PCR产物通过与硅芯片上的化合物共价结合后,在硅芯片上进行引物的退火,延伸反应,突变部位配对的碱基与正常配对的碱基不相同。根据引物在延伸反应中所结合的不同碱基的不同质量在质谱仪上显示不同峰而检测SNP。变性高效液相色谱(DHPLC)原理：目标核酸片段PCR扩增，部分加热变性后，含有突变碱基的DNA序列由于错配碱基与正常碱基不能配对而形成异源双链。因包含错配碱基的杂合异源双链区比完全配对的同源配对区和固定相的亲和力弱，更易被从分离柱上洗
7、脱下来,从而达到分离的目的。SNPs的有无最终表现为色谱峰的峰形或数目差异,依据此现象可很容易从色谱图中判断出突变的碱基。特点：使用高效液相色谱检测SNPs具有检测效率高，便于自动化的优点，对未知SNPs的准确率可达95%以上。但DHPLC检测对所用试剂和环境要求较高,容易产生误差,不能检测出纯合突变。MassARRAYSNP分型的方法多种多样，MassARRAY分子量阵列技术是Sequenom公司推出的世界上领先的基因分析工具，通过引物延伸或切割反应与灵敏、可靠的MALDITOF质谱技术相结合，实现基因分型检测。基于MassARRAY®分子量阵列平台的iPLE
