最新DNA重组技术的基本工具(1)教学讲义PPT.ppt

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1、DNA重组技术的基本工具(1)你还记得我们吗？氢键磷酸二酯键DNA聚合酶基因工程培育抗虫棉的简要过程：普通棉花(无抗虫基因)苏云金芽孢杆菌提取抗虫基因与运载体DNA拼接导入棉花细胞(含抗虫基因)转基因棉花植株1.1、DNA重组技术的基本工具“分子手术刀”--“分子缝合针”--“分子运输车”--限制性核酸内切酶DNA连接酶运载体1、简称：2、分布：一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”主要在原核生物中限制酶寻根问底(P4)你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是是什么吗？原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵

2、害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。限制酶在原核生物中的作用3、特点:一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”识别特定核苷酸列,特定位点切割（专一性）断裂：磷酸二酯键限制酶的识别特点以中轴线双侧的DNA上碱基呈反向对称，重复排列如：GAATTCCCCGGGCTTAAGGGGCCCEcoRⅠ黏性末端黏性末端Goback中心轴线两侧切开什么叫黏性末端？被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对

3、，这样的切口叫黏性末端。SmaⅠ平末端　　　平末端中心轴线处切开④作用：⑤结果：一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”切割DNA产生黏性未端和平末端3、特点:4、作用：5、结果：1、简称：2、分布：工具1：限制性核酸内切酶主要在原核生物中限制酶识别特定核苷酸列,切割特定切点（专一性）切割DNA产生黏性未端或平末端小结要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性(平)末端？要切两个切口，产生四个黏性(平)末端。如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？会产生相同的黏性(平)末端，然后让两者的黏性(平)末端黏合起来，就似乎可以合成重组的D

4、NA分子了。思考?Goback……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……EcoRⅠ……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……不同来源的DNA片段混合将不同种来源的DNA片段连接起来生物A基因片段生物B基因片段……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……酶切思考与探究P72、为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？通过长期的进化，含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开

5、。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。1、作用:把DNA片段拼接成新的DNA，2、作用原理：催化磷酸二酯键形成,不是氢键二、DNA连接酶——“分子缝合针”可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键T4DNA连接酶3、类型：E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶来源功能大肠杆菌T4噬菌体只能连接黏性末端能连接黏性末端和平末端寻根问底(P6)DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么?将单个核苷酸连接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键作用对象DNA

6、复制基因重租4、DNA连接酶与DNA聚合酶比较3、类型①E·coliDNA连接酶来源：大肠杆菌作用特点：只连接黏性末端②T4DNA连接酶来源：T4噬菌体作用特点：连接黏性末端和平末端2、作用原理：催化磷酸二酯键形成1、作用:：工具2：DNA连接酶把DNA片段拼接成新的DNA，4、DNA连接酶与DNA聚合酶比较小结P7.思考与讨论：限制酶在DNA的任何部位都能将DNA切开吗？以下是四种不同限制酶切割形成的DNA片段:你是否能用DNA连接酶将它们连接起来？…CTGCA…G①…AC…TG②CG…GC…③…G…CTTAA④G…ACGTC…⑤…GC…CG⑥GT…CA…⑦AATTC…

7、G…⑧②和⑦能连接形成…AC…TGGT…CA…④和⑧能连接形成…G…CTTAAAATTC…G…CG…GC……GC…CG③和⑥能连接形成①和⑤能连接形成…CTGCA…GG…ACGTC…反向对称4、DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗？迄今为止，所发现的DNA连接酶都不具有连接单链DNA的能力，至于原因，现在还不清楚，也许将来会发现可以连接单链DNA的酶。思考与探究P71、载体必须具备的条件：①能够在宿主细胞中复制或整合到受体细胞的染色体DNA上复制②具有一至多个限制酶切点，以便与外源基因连接③具有某些标记基因，便于进行筛选。④对