GenomeLabGeXP多重基因表达系统.docx

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1、GenomeLab™GeXP多重基因表达系统基因测序标准实验操作流程注意检测DNA的浓度和纯度1、DNA抽提2、PCR3、电泳注意检测回收产物的浓度和纯度4、割胶回收5、DTCS反应6、DTCS产物纯化7、GeXP上机测序结果分析（一）样本要求：1、新鲜组织或穿刺样本:至少0.5cm3，要置于-20℃保存。2、石蜡切片：厚度5-10µm的切片8-10张。面积至少1cm2，如果面积小，要增加切片数量。要置于4℃保存3、胸腹水：取5-50ml不等，一般有多少取多少。可置于4℃保存一天。样本选择注意事项：1.优先选择新鲜组织。2.石蜡切片样本中的核

2、酸会断裂及降解，因此如果采用石蜡切片样本，PCR可能会有未扩增的情况，为正常现象。3.肿瘤晚期患者，无法进行手术，可采用胸腹水样本。（二）样本前处理：1.新鲜组织及穿刺样本：将组织样本或穿刺样本剪碎，越小越好，放入1.5或2ml的离心管中。或将研磨机将组织研磨成粉末状。2.石蜡切片：用刀片将石蜡切片上的组织刮入1.5ml离心管中，加入1ml二甲苯，震荡、混匀，离心，倒掉，重复2-3次，尽可能去除组织中混有石蜡。再加入1ml100%的乙醇，震荡、混匀、倒掉，重复2-3次，尽可能去除二甲苯。3.胸腹水：去除胸腹水中的大块组织（抽取胸腹水时碰到的器

3、官表皮粘膜等），将胸腹水倒入10ml或50ml的离心管中，1000-2000rmp/min，离心12min，倒掉上清。加入2-5ml生理盐水，轻微震荡混匀，清洗沉淀，再次离心，倒掉上清。一、DNA抽提A：新鲜组织、穿刺样本、胸腹水（天根生化试剂盒）：1.使用前先在缓冲液GD和漂洗液PW中加入无水乙醇，加入体积参照瓶上的标签，在标签上打上“√”2.在处理好的组织及胸腹水中加入20μlProteinaseK，混匀。3.放入56℃水浴锅，直至组织溶解。水浴过程中，每过10-30min，将离心管上下颠倒，观察溶解情况，一般组织需要过夜。胸腹水2-3h

4、即可。4.加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。注意：加入缓冲液GB时可能会产生白色沉淀，一般70℃放置时会消失，不会影响后续实验。如溶液未变清亮，说明细胞裂解不彻底，可能导致提取DNA量少和提取出的DNA不纯。5.加人200μl无水乙醇，充分振荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。6.将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。7.向吸附柱

5、CB3中加入500μl缓冲液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。8.向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。9.重复操作步骤7。10.将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置5-10分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反

6、应（酶切、PCR等）实验。11.将吸附柱CB3转入一个干净的1.5ml离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50μl去离子水，室温放置3min，12,000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。B石蜡切片样本DNA抽提：（QiagenFFPEDNA提取试剂盒）1.使用前检查ATL，AL是否有结晶，如有，70℃放置，使其消失。检查AW1，AW2是否加入相应的无水乙醇，加入体积参照瓶上的标签。并在标签上打上“√”2.在处理过的石蜡切片样本中加入180μlATL,使样本悬浮。加入20μl蛋白酶K,震荡、混匀。3.56℃水浴一小时，直到样本溶解。每

7、过10-15min，上下颠倒离心管，观察样本溶解情况。可根据样本溶解情况，适当增加水浴时间。4.90℃水浴一小时。5.简短离心，加入200μlAL，震荡充分混匀。加入200μl无水乙醇，震荡充分混匀。6.简短离心，把产物全部加入柱子（柱子放在2ml管子上），8000rpm离心1min。倒掉离心管中的液体，将柱子重新放回离心管。7.加入500μlAW1，8000rpm离心1min，倒掉离心管中的液体，将柱子重新放回离心管。8.加入500μlAW2，8000rpm离心1min，倒掉离心管中的液体，将柱子重新放回离心管。9.14000rpm，离心3

8、min，倒掉离心管中的液体。将柱子放到新的离心管上。10.加入30-50μl的去离子水，对准柱子中心加。室温放置1min。11.14000rpm，离心1min，收集