tet基因表达调控系统及其应用

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1、万方数据中国医药生物技术2007年8月第2卷第4期ChinMedBiotechnoLAugust2007，V01．2。No．4姗Tet基因表达调控系统及其应用芦小燕，解慧琪，邓力基因治疗中导入基因表达时间和水平的调控极其重要。哺乳动物细胞中用到的诱导型载体主要与启动子有关，如热休克蛋白(Hsp)启动子可在高温下被诱导，还有重金属、糖皮质激素诱导的启动子等，但这些系统均存在着诱导表达不具备特异性、系统处于关闭状态时表达有遗漏以及诱导剂本身具有毒性会对细胞造成损伤等缺陷。如果设置一种导入基因的“开关”，能调控基因的表达，则有望大幅度提高基

2、因治疗在临床应用的安全性。1992年，Gossen和Bujard[1】首次成功地利用原核基因调控元件构建了真核细胞基因表达调控系统——四环素基因表达调控系统(Tet系统)，该系统能通过在培养基中加入或者去除四环素或其衍生物(如强力霉素)诱导或抑制所感兴趣基因的表达，故被广泛应用于基因表达调控、蛋白质功能和基因功能研究以及基因治疗研究中。本文就近年来Tet系统的研究进展等做一综述。1Tet系统概述1．1Tet系统作用原理大肠杆菌转座子Tnl0中Tet阻遏因子(Te吸)负性调节四环素抗性操纵子，TetR与四环素有很高的亲和性，在无四环素时

3、，TetR与Tet操纵因子序列(TetO)结合而阻断四环素抗性基因的表达；当四环素存在时，TetR对Teto的阻遏解除，转录启动，从而调控基因的表达。此原理应用到哺乳动物实验系统中，由表达TetR的质粒与另一个含有四环素调控元件(tetracycline．responseelement，TRE)和目的基因片段的质粒构成"let系统中两个重要的组成部分，后者上游为TRE，多克隆位点在TRE下游，并且因其含缺乏增强子的启动子——下游巨细胞病毒最小启动子(minimalimmediateearlypromoterofeytomegalovi

4、ms)而不能单独启动外源基因的表达。基于表达的调节蛋白不同，"let系统分为"let激活系统(Tet．on)和"let抑制系统(Tet-off)。在Tet-off系统中，TetR的第1～207个氨基酸与单纯疱疹病毒(HSV)VP16蛋白的C端127个氨基酸组成转录活化区域，融合表达"let调控的转录激活子(tet-controlledtranscriptionalactivator，tTA)。缺少四环素或强力霉素时，tTA的TetR结构域与TRE结合，激活目的质粒转录；在四环素或强力霉素作用下，缺少增强子使得目的基因的表达量很低或根本

5、不表达。"let．on系统与Tet-off系统很相似，只是其调节蛋白是反义的TetR(rTetR)，rTetR由Te吸中的4个氨基酸变化而形成【2】，与VPl6的转录活化区域融合表达反义四环素激活子(reversetetracyclinetranscriptionalacdvator，rtfA)，在强力霉素存在时，rtTA与TRE激活下游目的基因的转录。两个系统中，蛋白的调控表达与强力霉素的量以及诱导时间相关联。1．2Tet系统的改进Tet系统被广泛应用的过程中暴露出了不少问题，如TRE长期诱导表达的不稳定性，以及前后转染2个质粒到同

6、一细胞中需要采用两步法而费时费力等。为此，科学家们在努力对其进行改造。研究发现，诱导表达的不稳定性是由于tTA和rtTA有隐蔽剪接位点、原核密码子和完整的VPl6结构域，于是有研究者将rtTA的5个氨基酸置换，用人工化的密码子切除隐蔽剪接位点，以最小的VPl6结构域来优化Tet系统，所得到的反式作用子ttTA2S．M2使诱导表达的稳定性提高【31；有研究者将Tet系统改造成具有新霉素耐受基因和容易调节基因表达的启动子，不仅提供了一个简单的基因筛选标记，还提高了转染率，使基因表达更稳定朋；还有研究者通过含有抗性基因增强型绿色荧光蛋白(E

7、GFP)和荧光素酶基因的双向调控质粒，采用Tet系统和构建质粒共转染，一步得到了表达rtTA的细胞克隆，既省时又省力【5】。病毒载体具有较高的转染效率，因此可将病毒载体与Tet系统作用元件相结合以达到提高转染效率、诱导高水平的基因表达的目的。Peng等【6】通过带有高效率自我阻碍性的反转录病毒载体，有效转染来自肌肉的干细胞，体外能诱导高水平的基因表达，在体内也能系统调节骨的形成。Berenjian掣’7】利用单病毒染色体的二元腺病毒载体来编码TRE和Tet系统转录激活蛋白，并引入阻碍转录延伸的乳糖抑制蛋白，使该系统更为多能化，蛋白表达

8、也得到了较好地调控。Barde等【8l通过Tet-on系统的病毒载体有效控制造血系统的基因表达。Hayakawa等[9-tol应用Tet-off系统使蝴蝶状红斑综合征基因Blm在胚胎干细胞中条件性调控表达，但是随后发现B