第十二章--其他分子诊断检测技术.ppt

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1、第十二章其他分子诊断检测技术临床生物化学教研室付祖姣博士目录第一节基因变异检测技术第二节脉冲电场凝胶电泳第三节分子影像第一节基因变异检测技术检测已知的基因突变检测未知的基因突变分子诊断检测基因突变的目的：几种常见的基因变异检测方法PCR扩增阻碍突变系统寡核苷酸连接实验温度梯度凝胶电泳和变性梯度凝胶电泳变性高效液相色谱法错配接合蛋白质截短测试法一、PCR扩增阻碍突变系统(PCRamplificationregractorymytationsystem,PCR-ARMS)以PCR方法为基础，检测已

2、知点突变的一种方法。又叫做PCR等位基因特异性扩增法（PCRamplificationofspecificalleles,PASA）或等位基因特异性PCR(alleles-specificPCR,ASPCR)（一）基本原理PCR的引物3’末端的核苷酸与模板之间存在错配时，PCR扩增效果差，或者不能扩增。模板3’5’引物5’3’×ATGTTATACAACPCR-ARMS设计2对引物，一对引物（P1）与正常基因完全匹配，一对引物(P2)与突变基因完全匹配。用这两对引物分别扩增模板。如果模板基因为正常基

3、因，那么P1扩增可以得到大量产物，而P2无产物。如果模板已经突变，那么P2扩增可以获得大量产物，而P1无产物。PCR-ARMS基本原理PCR-ARMS5’3’3’5’ATGGTTCCTGTACCAAGGAC5’3’3’5’ATGGTACCTGTACCATGGAC突变等位基因正常等位基因顺利延长不能延长5’3’ATCGTT5’3’ATCGTT×突变基因的引物P2的扩增PCR-ARMS（二）应用检测单一点突变基因分型检测多位点突变PCR-ARMS的应用1.检测单一点突变设计一对引物，可以扩增突变基因而

4、对正常基因呈扩增阻遏；附加一对引物，可以扩增标志性基因作为阳性对照；PCR扩增完成，进行电泳，即可得知点突变是否发生。MMGNG异常阳性对照突变基因PCR-ARMS的应用2.基因分型可用于单个突变的基因分型（鉴别杂合子和纯合子）或多态性分析PCR-ARMS的应用1:正常基因的引物扩增结果；2：突变基因的引物扩增结果MWt1Wt2Ht1Ht2Hm1Hm2野生纯合子杂合子突变纯合子方法一：正常等位基因野生纯合子点突变突变杂合子稳定遗传突变纯合子方法二：野生纯合子杂合子突变纯合子MWtHtHm5’3’3

5、’5’496bp371bp野生型基因引物突变型基因引物突变点PCR-ARMS的应用3.检测多位点突变突变点1突变点2片段1片段2PCR-ARMS的应用PCR-ARMS可同时检测多个点突变。（三）方法学评价适用于较少点突变的检测；具有低-中等批量处理能力；可借助多重PCR检测多个点突变；无需放射性标记；无需昂贵的试剂；无需复杂的检测系统PCR-ARMS优点缺点只能检测已知的基因突变及多态性二、寡核苷酸连接实验(oligonucleotideligationassay,OLA)利用DNA连接酶，将2段

6、寡核苷酸探针顺向连接，从而检测靶基因型的一种方法。该方法因为可靠、精确、重现性好，已成为临床遗传病分子诊断的一种基本方法。（一）基本原理嗜温性或耐热的连接酶具有高特异性和高保真性，它能连接与模板序列完全互补的两段核苷酸片段。OLA的基本原理DNA连接酶5’3’TACCAAGGACGATTCCTGATCATGGTTCCTGCTAAGGACTAG3’5’5’3’TACCAAGGACGATTCCTGATCATGGTTCCTACTAAGGACTAG3’5’×双等位基因变异的检测OLA的基本原理探针15’等

7、位基因A3’TACCAAGGACGATTCCTGATCATGGTTCCTGCTAAGGACTAG3’5’TACCAAGGAGGATTCCTGATCATGGTTCCTCCTAAGGACTAG3’5’探针25’等位基因a3’通用探针OLA实验的操作耐热连接酶，可使变性和连接连续进行，产物呈线性增长，大大增加了检测的灵敏度；若PCR扩增引物的Tm值大于探针的Tm值，可在同一管内先进行PCR，再进行OLA实验，大大减少了污染，提高检测效率。2.条件：1.反应体系：3.方法的发展：2个探针、DNA连接酶、模

8、板探针与靶序列的杂交区域足够长（>20bp）温度：能使探针和靶序列杂交OLA的基本原理（二）临床应用镰状细胞贫血症的分子诊断、产前检查多种遗传病及常见病的检测(P168)；局部地区人群的遗传病分子检测PCR-OLA的应用（三）方法学评价能可靠地鉴别基因型及纯、杂合子；不容易产生假阴性和假阳性结果；利用耐热连接酶循环进行连接，使信号放大，更增强了该法的灵敏度优点：缺点：需要多相参与，增加实验的复杂度；需要PCR扩增与OLA相结合，PCR的非特异性扩增导致了该方法的重现性不够PCR-O