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1、资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。A549/DDP细胞凋亡及其机制的研究1材料1.1主要仪器荧光显微镜及照相系统:Olympus公司垂直电泳槽:Bio-Rad公司电转移槽:Bio-Rad公司恒温摇床:江苏太仓仪器公司分光光度仪:Bio-Rad公司遥控酶标仪:TECAN公司台式高速离心机:eppendorf公司其余同前两部分1.2普通耗材50mL/250mL细胞培养瓶:Nunc公司6孔细胞培养板:Costar公司60mm细胞培养皿:Costar公司细胞刮刀:Nunc公司1.3主要试剂Hoechst33258染色试剂盒:
2、碧云天公司PI和AnnexinV-FITC:美国BD公司TUNEL试剂盒:罗氏公司鼠抗人Caspase-8p10单抗:CellSignalingHRP标记羊抗鼠二抗:武汉博士德公司BCA法蛋白定量试剂盒:Pierce公司ECL发光检测试剂盒:Pierce公司硝酸纤维素转移膜(0.22μm)Amersham公司DAB北京中杉公司其余试剂同前两部分资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。1.4常见缓冲液及培养基结合缓冲液(×10):100mmol/LHEPES(PH7.5)1.4moLNaCl25mmol/LCaCl2单去圬剂
3、裂解液:50mmol/LTris-HCl(PH8.0)150mmol/LNaCl1%TritonX-100100g/mLPMSF5×SDS蛋白上样缓冲液:250mmol/LTris-HCl(PH6.8)10%SDS50%甘油0.5%溴酚蓝500mmol/LDTT(临用前现加)电泳缓冲液:25mmol/LTris-HCl(PH7.4)250mmol/L甘氨酸(PH8.3)0.1%SDS转移缓冲液:5.6mmol/LTris-HCl(PH7.4)120mmol/L甘氨酸0.1%SDS20%甲醇(V/V)储存于4℃备用PBS缓冲液资料内容仅供您学习参
4、考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。137mmol/LNaCl2.7mmol/LKCl10.0mmol/LNa2HPO42.0mmol/LKH2PO4调节至PH=7.4洗涤缓冲液(PBS-Tween-20):1000mLPBS(PH7.4,0.01M)500μLTween-20封闭缓冲液:5g脱脂奶粉100mLPBST1.5细胞系同第一部分2方法2.1A549/DDP细胞凋亡的检测2.1.1细胞凋亡形态学观察将A549/DDP细胞分别加入到含盖玻片的6孔细胞培养板中,每孔细胞数为1×104个,培养过夜后,去培养液,加入含姜黄素终浓度为0、
5、5、l0、20、30、40μmol/L的培养液继续培养24h后终止培养,取出细胞爬片,按照Hoechst33258染色试剂盒说明书进行染色。①在细胞爬片上,轻轻滴加约500μL固定液,以刚覆盖爬片为宜,固定10分钟。②去固定液,用PBS洗两遍,每次3分钟,吸尽液体,洗涤时用手晃动数次。③加入0.5mLHoechst33258染色液,染色5分钟,用手晃动数次。④去染色液,用PBS洗两遍,每次3分钟,吸尽液体,洗涤时用手晃动数次。⑤滴加一滴抗荧光淬灭封片剂于载玻片上,盖上贴有细胞的盖玻片,让细胞接触封片剂,避免气泡。资料内容仅供您学习参考，如有不当
6、或者侵权，请联系改正或者删除。⑥上荧光显微镜观察,激发波长350nm,发射波长460nm。2.1.2原位末端标记(TUNEL)染色同上方法制备细胞爬片,PBS洗涤,4%多聚甲醛固定后,按照TUNEL试剂盒说明书操作。①在细胞爬片上,轻轻滴加约500μL固定液,以刚覆盖爬片为宜,固定30分钟。②PBS洗片两次,每次3分钟,吸尽液体,洗涤时用手晃动数次。滴加内源性过氧化物酶阻断剂(0.3%H2O2-甲醇溶液),室温孵育30分钟。③同上用PBS洗片,滴加通透液(0.1%TritonX-100溶于0.1%枸橼酸钠溶液中),在冰浴中孵育2分钟。④PBS洗
7、两次,滴加50μL的TUNEL反应混合液,湿盒中室温孵育60分钟。⑤PBS洗两次,滴加50μL的转化剂-POD,湿盒中37℃孵育30分钟。⑥PBS洗两次,加入DAB底物溶液,室温孵育10分钟。⑦PBS洗两次,封片。光镜下观察。⑧结果判定:细胞核中有棕褐色颗粒者为阳性。每张片至少观察500个细胞,计算每100个细胞内的阳性细胞,即凋亡指数(apoptoticindex,AI)。2.1.3流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡①取对数生长期A549/DDP细胞,常规消化,制备成105/mL细胞悬液。②接种于直径60mm培养皿中,每孔4mL,细胞培养箱中过
8、夜培养。③次日吸弃原细胞培养液,加入含姜黄素终浓度为0、5、l0、20、30、40μmol/L的培养液,继续培养24h。④常规消化,4℃离心
