胰岛素提取分离工艺.ppt

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1、1.2胰岛素提取分离工艺1.2.1胰脏低温保藏1.2.2组织捣碎及细胞破碎1.2.3提取一液固萃取分离法二固液分离方法1.2.4纯化与精制一沉淀法二柱层析法三浓缩四结晶五干燥胰脏冷冻胰脏刨碎成片提取碱化、酸化减压浓缩去脂、盐析精制一、胰脏冷冻胰脏在冻结状态下粉碎，有利于细胞膜的破裂使之提取完全，并可避免蛋白水解酶对胰岛素的破坏。二、胰脏刨碎成片刨碎成片有利于与酸醇提取剂充分接触，增大提取率。三、提取1）pH为2.5~3.0（胰岛素在酸性条件下稳定）2）乙醇含量为70%左右。（在此浓度下，胰岛素溶解度

2、比较大，过高会使胰岛素变性）3）温度为13~15℃（低温，保持胰岛素活性）四、碱化、酸化提取液在不断搅拌下加入浓氨水调pH值到8.0~8.4（温度13~15℃）立即进行过滤，除去碱性杂蛋白质，滤液应澄清，并及时用硫酸酸化至pH值到3.6~3.8.降温至5℃静置4小时以上，使酸性杂蛋白充分沉淀。操作注意事项去除杂碱性蛋白后应立即调溶液的pH值至酸性（在碱性条件下，胰岛素会散失活性，综合考虑去除杂蛋白的因素，故应立即调至酸性）五、减压浓缩吸上层清液至真空蒸发器内，下层用帆布过滤，沉淀物弃去，滤液并入上清

3、液。清液在30℃以下减压蒸去乙醇，浓缩至浓缩液比重为1.04~1.06（约为原来体积的1/9~1/10）为止。在这步操作中，主要是用来缩小溶液的体积，浓缩至一定的浓度，以便于下步的盐析操作。六、去脂、盐析浓缩液转入去脂锅，5分钟内加热至50℃，立即用冰盐水降温至5℃，静置3-4小时，分离出下层清液（脂层可回收胰岛素）。调pH值至2.3~2.5，于20~25℃在搅拌下加入27%（W/V）固体氯化钠，保温静置数小时，析出之物即为胰岛素粗品。脂肪加热溶解，密度小，浮在上层液，迅速冷却将其去除七、精制1）第

4、一次结晶获得较纯的胰岛素，等电点结晶法，离心分离2）第二次结晶结晶、离心，同上3）干燥生物大分子制备得到所需的产品后，为了防止变质易于保存和运输，常需要干燥处理，最常用的方法是真空干燥和冷冻干燥，某些无活性核酸、微生物酶制剂和酪蛋白等产品则较多应用喷雾干燥、气流干燥等直接干燥法。干燥可获得普通胰岛素，含有2~5%的杂质，包括胰岛素原、胰岛素二聚体、胰多肽等，层析时有A、B、C三个峰，C峰才是胰岛素。4）柱层析将结晶胰岛素经过凝胶过滤层析，胰岛素纯度达97%以上，此时在色谱图上仅占一个峰，故称单峰胰岛

5、素。经过凝胶过滤层析可获得单峰纯胰岛素，若将单峰胰岛素再用离子交换层析法进一步纯化，去除胰岛素原等杂质，使其纯度提高到99%以上。目前国内不能生产，尚依赖进口。其特点是：纯度高，副作用极少，生物效价高。5）锌沉淀在收集液中加入4mol氨水调pH值至6.2~6.4，加入3.6%（V/V）的醋酸锌溶液（此溶液浓度为20%），在用4mol氨水调pH值至6.0，低温放置过夜，离心得到沉淀。6）第三次结晶第三次等电点结晶，离心收集纯度高的胰岛素锌盐。7）干燥获得白色粉状胰岛素8）制剂胰岛素口服液能受胃肠消化酶

6、分解而失效，因而必须制成注射液：有胰岛素注射液、蛋白锌胰岛素注射液、精蛋白锌胰岛素注射液等。1.2.1胰脏低温保藏1）冷却：使组织温度尽快降到0~4℃范围，而又不呈冷结状态，这种方法储藏的组织叫冷却组织2）冷冻：为了达到长期保藏的目的，将胰脏进行深度冷冻，使组织中大部分水分冻结冰结晶，阻碍了微生物的活动或生物反应，从而增加了胰脏的储藏时间。这种方法保藏的胰脏叫冷冻胰脏。1.2.2组织捣碎及细胞破碎------1.2.21、组织捣碎目前工业生产中常用的组织捣碎是通过机械破碎方法而实现的。例如通过刨削机

7、、组织破碎机等机械设备。2、细胞破碎有许多生物活性物质位于细胞内部，在细胞培养（或发酵）过程中不能分泌到细胞外的培养液（或发酵液）中。如青霉素酰化酶、碱性磷脂酶等胞内酶，必须在固液分离之前先将细胞破碎，使细胞内产物释放到液相中，然后再进行固液分离。1.2.3提取一液固萃取分离法二固液分离方法一液固萃取分离法（浸取）---见1.2.3胰岛素可溶于稀酸、稀碱和稀醇溶液，但在组织中与其共存的糜蛋白酶对胰岛素有极高的水解活性，因而采用6.8%乙醇溶液并用草酸调溶液的pH为2.5~3.0，进行提取，这样就从三

8、个方面抑制了糜蛋白酶的水解活性：①6.8%的乙醇可以使糜蛋白酶暂时失活；②草酸可以除去激活糜蛋白酶的Ca2+；③选用pH2.5~3.0，是糜蛋白酶不宜作用的pH值。以上条件对胰岛素的溶解和稳定性都没有影响，可以除去一部分在稀醇与稀酸中不溶解的杂蛋白。二固液分离方法—见1.2.3