高通量体内Pig-a基因突变方法检测二甲基肼的遗传毒性.doc

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1、高通量体内Pig-a基因突变方法检测二甲基肼的遗传毒性蒲江1,2＊，谭小燕1,2，张海洲3，王欣1，耿兴超1，李波1，黄芝瑛2＊＊，王雪1＊＊(1中国食品药品检定研究院国家药物安全评价监测中心，2中山大学药学院，3罗氏研发（中国）有限公司)目的：建立高通量体内Pig-a基因突变试验方法，并采用该方法研究二甲基肼（DMH）的遗传毒性。材料和方法：将16只5周龄雄性SD大鼠随机分为阴性对照、DMH低剂量、DMH高剂量和阳性对照组，阴性对照组ig给予灭菌注射用水，DMH组分别ig给予20mg·kg-1和60mg·kg-1DMH溶液（连续3d），阳性对照组ip给予100mg·kg-1乙基亚硝

2、基脲（ENU）（连续3d）。给药前和末次给药后第7、14、28d尾静脉采血，取80μl用淋巴细胞分离液处理得到高纯网织红细胞（RETs）和成熟红细胞（RBCs）液，孵育Anti-CD59-phycoerythrin和Anti-CD61-phycoerythrin抗体，再标记Anti-PE-Microbeads（抗PE顺磁微珠），定量稀释至1000μl。准确量取15μl红细胞稀释液，用核酸染料（SYTO13-FluoresceinIsothiocyanate）和计数微球混合液稀释至1500μl（柱前样本），用于流式分析，计算NTotalRETs/N柱前Beads和NTotalRBCs/

3、N柱前Beads值；剩余985μl红细胞液采用免疫磁性柱(LScolumns)浓缩，得到高浓度突变型红细胞液，离心，用核酸染料和计数微球混合液稀释至300μl（柱后样本），流式分析得到计数微球（N柱后Beads）、突变型RETs（NMutationalRETs）和突变型RBCs（NMutationalRBCs）数量。根据公式m=NMutationalRETsorRBCs/（NTotalRETsorRBCs×N柱后Beads/N柱前Beads）×100%，计算RETs和RBCs的突变率（m），所得数据采用Wilcoxon秩和检验进行统计分析。结果：本高通量法分析RETs和RBCs数目分

4、别高达3.11×107个和8.01×108个，空白组动物背景值范围mRETs为0.56×10-6-7.83×10-6，mRBCs为0.35×10-6-6.86×10-6，且每个样本流式总检测时间缩短至8min。给药后第7d时，阴性组mRETs为5.74×10-6，DMH低、高剂量组分别为3.23×10-6、4.82×10-6，阳性组为1.50×10-4，阳性组是阴性组的26.1倍；阴性组mRBCs为2.61×10-6，DMH低、高剂量组分别为1.33×10-6、2.81×10-6，阳性组为1.18×10-5，阳性组是阴性组的4.5倍。给药后第14d时，阴性组mRETs为4.15×10

5、-6，DMH低、高剂量组分别为0.87×10-6、0.74×10-6，阳性组为5.70×10-4，阳性组是阴性组的137.3倍；阴性组mRBCs为2.68×10-6，DMH低、高剂量组分别为2.25×10-6、3.33×10-6，阳性组为4.06×10-5，阳性组是阴性组的15.1倍。给药后第28d时，阴性组mRETs为3.36×10-6，DMH低、高剂量组分别为2.54×10-6、1.56×10-6，阳性组3只动物死亡，剩余1只动物mRETs为1.75×10-5，是阴性组的5.2倍；阴性组mRBCs为1.81×10-6，DMH低、高剂量组分别为2.25×10-6、3.90×10-6

6、，阳性组为1.64×10-4，阳性组是阴性组的90.7倍。结论：成功建立了高通量体内Pig-a基因突变检测方法。与阴性组相比，阳性组RETs和RBCsPig-a基因突变率随时间呈明显上升趋势（P<0.05）。在设计剂量范围内，DMH低、高剂量组与阴性对照相比Pig-a基因突变率无明显变化。在本实验条件下，经口给予大鼠DMH未引起Pig-a基因突变率上升。［关键词］Pig-a基因；免疫磁性；计数微球；流式细胞术；二甲基肼