IL-18基因工程菌培养基的选择.ppt

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1、IL-18基因工程菌培养基的选择能源08第二小组组员：16号-30号IL-18是一种新型细胞免疫调节因子，主要由激活的巨噬细胞产生，在体内分布广作用呈多样化、能诱导多种细胞因子产生、上调Fas配体的表达、介导T细胞及NK细胞的细胞毒活性、增强机体抗肿瘤机能，既能提高特异性免疫又能提高非特异性免疫。以下以IL-18重组基因转入大肠杆菌为例子：目的基因为IL-18的编码序列（cDNA），采用RT-PCR技术从外周血细胞中获得。首先据Genebank报道序列设计引物，并在引物的5’端引入EcoRI位点和启始密码子

2、ATG，在3’端引入HindⅢ位点。IL-18基因的RT-PCR扩增产物经EcoRI和HindⅢ双酶切插入表达载体pBV220的相同位点即得IL-18的表达载体pBV220-IL-18。构建的表达载体pBV220-IL-18按常规方法转化大肠杆菌DH5α株后即得IL-18基因的工程菌。IL-18基因工程菌在基因工程菌的构建构成中，培养基是影响菌体生长及产物合成的主要因素之一，通过正交实验、均匀实验或RSM法优化培养基成份可使外源蛋白的表达量大大增加。培养基按用途可分为种子培养基和发酵培养基等.种子培养基用于

3、种子的逐级扩大培养，同时，为了保持菌种的稳定性，可在种子培养基中加入适量的相应抗生素作为选择性压力.发酵培养基则应针对不同的工程菌筛选和优化，以维持菌体生长至较高密度和目的基因的高效表达，它一般应包括碳源、氮源、无机盐等，对有些工程菌，还需要维生素等。基因工程菌中培养基发酵培养基是发酵生产中最主要的培养基，它不仅耗用大量的原材料，而且也是决定发酵生产成功与否的重要因素。（1）根据产物合成的特点来设计培养基：对菌体生长与产物合成相偶联的发酵类型，充分满足细胞生长繁殖的培养基就能获得最大的产物。对菌体生长与产物

4、合成不相偶联的发酵类型，既要考虑前期细胞的生长繁殖，还要考虑后期目标产物的代谢合成，一般在产物合成时需要添加某些成分。（2）发酵培养基的各种营养物质的浓度应尽可能高些，这样在同等或相近的转化率条件下有利于提高单位容积发酵罐的利用率，增加经济效益。（3）发酵培养基需耗用大量原料，因此，原料来源、原材料的质量以及价格等必须予以重视。发酵培养基使用不同的碳源对菌体生长及外源基因表达有影响。葡萄糖和甘油相比，它们所导致的菌体比生长速率及呼吸强度相差不大，但甘油的菌体得率较大，而葡萄糖所产生的副产物较多。氮源的作用主

5、要是提供氨基酸、蛋白质、核酸等合成所需的元素氮。不同的氮源对工程菌的生长及产物表达具有不同的影响。发酵培养基不同成分的不同的影响无机磷在许多初级代谢的酶促反应中是一个效应因子，如在DNA、RNA、蛋白质的合成，糖代谢、细胞呼吸及ATP水平的控制中。过量的无机磷会刺激葡萄糖利用、菌体生长和氧消耗。Jensen等科学家在进行补料分批培养时，降低培养基中磷含量，使菌体生长受到抑制，再加大葡萄糖流加速率，可进一步提高重组蛋白产量一倍。培养基中各成分浓度过低或过高都不利于菌体的生产和产品的表达。一般来说，下列物质当其

6、浓度大于括号内值时均会抑制E．coli的生长：葡萄糖(29／L)、氨(39／L)、铁(1．159／L)、镁(8．79／L)、磷(109／L)和锌(0．0389／L)。发酵培养基不同成分的不同的影响培养基的选择是影响IL-18基因工程菌的高效表达的重要因素之一。其中适合培养大肠杆菌工程菌的培养基大概有：LB培养基，M9培养基，MBL培养基，2×YT培养基等等。一个良好的培养基为菌体生长提供必要条件，但菌体对培养基的利用受培养条件的限制。影响菌体生长的培养条件包括：温度、PH、溶氧、比生长速率等。。LB培养基分

7、为液体LB培养基和固体LB培养基。液体LB培养基配方：胰蛋白胨(Tryptone)10g、酵母提取物(Yeastextract)5g、氯化钠(NaCl)10g溶解于800ml水中，另外根经验值用NaOH调节该培养基的pH,使其达到7.4，再定容至1000ml。固体培养基：1.配制：100mlLB培养基加入1.5g琼脂粉2.抗生素的加入：高压灭菌后，将融化的LB固体培养基置与55℃的水浴中，待培养基温度降到55℃时（手可触摸）加入抗生素，以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。3.倒板：一般10ml倒1个板子

8、。培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外下照10-15分钟。4.保存：用封口胶封边，并倒置放于4℃保存，一个月内使用。LB培养基LB培养基突出特点是营养成分丰富，其中含有丰富的氨基酸、小肽、小分子糖类和各种营养因素，有利于菌种的快速生长。含大量的大分子营养物，要使细菌很好地利用，必须首先动员菌体内酶系统（如蛋白水解酶）对大分子营养物进行分解。该培养基较适于种子活化与种子扩增使用。LB培养基特点M9培养基,一种培养大