猪圆环病毒2型新型疫苗的研制及中和抗体快速检测方法的建立.docx

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1、猪圆环病毒2型新型疫苗的研制及中和抗体快速检测方法的建立猪圆环病毒2型（PCV2）感染导致多种猪圆环病毒2型相关疾病（PCVAD）,给全球养猪业造成巨大的经济损失。疫苗接种是预防PCVAD最经济有效的方法。随着免疫压力的加大,PCV2病毒在快速进化,而现有商业化PCV2疫苗的疫苗株均是PCV2a或者PCV2b基因型,其对临床占主导地位的PCV2d毒株的防控效果存有争议。因此研发广谱、高效的PCV2新型疫苗尤为重要。本研究从猪圆环病毒2型流行病学调查、新型疫苗研制以及疫苗效果快速评估方法的建立等方面入手,以期

2、为PCVAD的防控提供必要工具。获得的结果如下:1.于2016-2018年间从全国65家猪场的217份临床样本中,分离获得48株PCV2毒株,测定其基因组序列并进行PCV2遗传变异与进化分析。48株PCV2毒株中PCV2a、PCV2b与PCV2d占比分别为4/48、13/48和31/48。其中,PCV2d亚型在2016年、2017年和2018年占比分别为54.5%、65.2%和71.4%,表明PCV2d亚型在我国逐年增加,并占有优势地位。48株PCV2毒株的基因序列同源性为93.4%-100%。RDP4.0

3、软件分析分离的48株PCV2毒株,未见重组事件。PCV2d的主要抗原表位(⁴³D/G、¹¹⁵D/G、¹³⁴N/T、¹⁶⁵P/T、¹⁶⁹G/R/S、²¹⁰E/G/D)存在较高的氨基酸残基多样性。仔猪攻毒PCV2dHeB-1株后14、21d血清中病毒滴度均高于PCV2bLN-3株,但差异不显著（p>0.05）。攻毒仔猪的腹股沟淋巴结中PCV2抗原的含量在PCV2dHeB-1株

4、和PCV2bLN-3株之间无明显差异。2.将PCV2HeB-1株的ORF2基因与分子佐剂—补体C3d-P28进行融合,开发出一种新型PCV2DNA疫苗（pVOC3）。pVOC3疫苗免疫仔猪后攻毒,可显著减少仔猪血清中PCV2b或PCV2d的病毒拷贝数,产生较高的PCV2特异性抗体,并刺激PCV2特异性干扰素γ分泌细胞的产生,与未加C3d-P28佐剂的试验组（pVO）差异显著（p<0.05）。3.利用马赛克T-细胞疫苗设计软件获得PCV2病毒的马赛克Cap蛋白,其对66条参考PCV2Cap蛋白具有较好的

5、表位覆盖,与PCV2HeB-1株、PCV2LN-3株和PCV2LG株的同源性分别为98.3%、97.0%、91.8%。马赛克Cap蛋白诱骗表位（169-180aa）用PanDRT辅助细胞表位替换,获得一个改构马赛克Cap蛋白。以PCV2HeB-1基因组为骨架,将其Cap蛋白基因用优化的改构马赛克Cap蛋白基因进行替换,新设计的PCV2病毒基因组全基因合成后进行真核表达载体构建、PK-15细胞转染及筛选,获得一株新型PCV2毒株,命名为马赛克PCV2SD株。马赛克PCV2SD株制成疫苗免疫小鼠,小鼠血清中检测

6、不到诱骗抗体,且与PCV2HeB-1免疫组相比,血清中和抗体水平提高1.6倍以上。4.将含猪干扰素-γ基因（PoIFN-γ）的真核表达质粒转染PK-15细胞,获得一株可稳定表达PoIFN-γ的PK-15细胞系,命名为PK15-PoIFN-γ细胞系。PK15-PoIFN-γ细胞可显著增强马赛克PCV2SD株的增殖效率,病毒毒价达1×10^8.4TCID₅₀/mL以上,且连续传15代后对病毒的增殖无影响。5.改构马赛克Cap蛋白经密码子优化后成功实现大肠杆菌高效表达。改

7、构马赛克Cap蛋白与Gel01ST佐剂乳化制备成疫苗并免疫仔猪,免疫后14d仔猪血清中即可检测到PCV2特异性抗体,攻毒后仔猪未检测到病毒血症,组织病理变化轻微,腹股沟淋巴结中PCV2病毒含量很低,PCV2特异性IFN-γ-SC的数量显著增加,与攻毒对照组相比差异显著（P<0.05）。同时,改构马赛克Cap蛋白亚单位疫苗对PCV2dHeB-1株、PCV2bLN-3株均能达到保护效果。6.改构马赛克Cap蛋白与佐剂乳化后免疫小鼠制备单克隆抗体,获得15株单抗并完成其中4株单抗（2C5、4G7、5F7、6

8、F8）的鉴定。4株单抗均与改构马赛克Cap蛋白发生特异性反应,与PCV2病毒产生特异性的免疫荧光信号,且与CSFV、PRRSV、PRV、PPV等猪常见病毒无特异性反应。单抗6F8、2C5为PCV2的中和性抗体,其中单抗6F8对PCV2病毒各基因型均有中和活性,而单抗2C5仅对PCV2d亚型毒株有中和活性。7.以PCV2中和单抗6F8为基础,制备了一种PCV2血清中和抗体阻断ELISA试剂盒。以血清中和抗体检测试验