附件1：第四届生物实验技能竞赛指南.docx

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1、附件1：第四届生物实验技能竞赛指南1、预赛笔试：微生物学实验安全与环保知识，微生物学基本理论和实验操作技术。具体包括：显微镜观察技术、微生物纯种分离培养技术及无菌操作技术、微生物测微技术和计数、培养基制备和灭菌、常规仪器的使用及规范操作。2、决赛实验操作：培养基配制及微生物分离、革兰氏染色一、实验原理培养基是一种由人工配制的适合微生物生长繁殖和累积代谢产物的混合养料。虽然培养基种类名目繁多，但就其营养成分而言，不外乎含有碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子和水等六大类。由于微生物营养方式不同，利用各种营养物

2、的能力也有差异，因此，必须根据各种微生物的特点及实验目的选用合适的培养基。培养基除了满足微生物所必需的营养物质之外，还要求有适宜的酸碱度和渗透压。不同的微生物对pH的需求不一样，大多数细菌、放线菌生长的最适pH值为中性至微碱性，而酵母菌和霉菌则偏酸性，所以配制培养基时都要将pH值调至合适的范围。革兰氏染色法可将所有细菌分成革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G－）两大类，是细菌学上最常用的鉴别性染色法。基于细菌的细胞壁结构和成分的不同，G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度

3、低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经沙黄复染后就染成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层较厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。二、实验器材1、设备：灭菌锅、显微镜、煤气灯/酒精灯、天平。2、材料：试管、试管架、培养皿、三角烧瓶，量筒，玻棒、烧杯、载玻片、接种环、微生物菌种、pH试纸（pH5.4—9）、标签纸、牛角匙、牛皮纸、棉花、纱绳、移液枪/枪头（1mL、0.2mL

4、）、擦镜纸、吸水纸、洗瓶。3、试剂：培养基、1mol/LNaOH、1mol/LHCl、染色试剂、香柏油，二甲苯、生理盐水、无菌水。三、实验步骤1.培养基配制灭菌、微生物的分离（1）称量：按照培养基的配方，准确称取各种药品。（2）加热溶解：将称好的各种药品根据要求加热溶解。（3）pH值调节：用酸或碱调节，直到培养基达到所需的pH值。（4）分装：将配制好培养基分装于容器内。（6）加塞包扎：根据不同的玻璃器皿加上不同的塞子包扎，防止造成污染。（7）灭菌：使用高压灭菌锅对培养基及器皿进行灭菌。（8）铺平板：按要求

5、制作平板。（9）划线分离：在火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，在平板上划线。将样品在平板上进行稀释，使形成单个菌落。（10）培养与观察：将平板置于37℃培养箱培养，观察分离结果。2.革兰氏染色（1）涂片：挑少许菌种正确涂片。（2）干燥、固定：涂片在空气中干燥。手执玻片一端，有菌膜的一面朝上，玻片在微火上通过3次。（3）染色：待冷却后，再加染料。初染、媒染、脱色、复染。（4）镜检：用油镜观察，记录结果。（5）革兰氏染色：结果判断。四、要求1、参赛前做好预习报告（内容：实验名称、实验目的、实验原理、实验器材、

6、实验步骤、数据记录、结果判断），实验在2小时内完成（包括在预习报告基础上完成实验报告：数据处理、实验结果与讨论）；2、所有的试剂、药品整理复位；3、所用的玻璃器皿洗干净后放回原处；4、显微镜使用后必须清理镜头然后归位；5、灭菌完毕，灭菌锅必须切断电源。