小议铜绿假单胞菌整合子与多重抗药性探索.doc

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1、小议铜绿假单胞菌整合子与多重抗药性探索摘要目的在铜绿假单胞菌中检测1类整合子并分析整合子对细菌耐药性的影响。方法用VITEK-AMS微生物自动分析仪鉴定细菌和药敏试验，用PCR方法扩增I类整合酶基因，经电泳后检测扩增产物。结果158株铜绿假单胞菌中检测出1类整合子42株，检出率为26.6%。1类整合子阳性菌对氨基糖苷类、喹诺酮类及头孢菌素类药物表现出较高的耐药率。携带1类整合子菌株易表现出对至少4种抗菌素的多重耐药性，其多重耐药率为68.6%(33/48)，明显高于1类整合子阴性菌株（28.6%），P＜0.05。结论1类整合子广泛存在铜绿假单胞菌中,1类整合子对细菌多重耐药性的产生和传播起着重

2、要作用，应加强临床细菌基因水平的耐药监测，采取有效措施防止耐药性的传播。关键词铜绿假单胞菌整合子多重耐药铜绿假单胞菌为条件致病菌，是医院内感染的主要病原菌之一。患代谢性疾病、血液病和恶性肿瘤的患者以及术后或某些治疗后的患者易感染本菌。本菌引起的感染病灶可导致血行散播，而发生菌血症和败血症。烧伤后感染了铜绿色假单胞菌可造成死亡。随着抗生素的广泛使用和不合理使用，使包括铜绿假单胞菌在内的多种细菌的耐药性问题日益严重。整合子是与细菌耐药性传播有关的基因系统，整合子通过捕捉和整合细菌耐药基因，在细菌耐药性的传播和扩散中起了重要的作用。整合子通过位点特异性的基因重组可整合多种耐药基因对细菌多重耐药的形成

3、起着重要作用。本文对158株铜绿假单胞菌进行分析，以探讨铜绿假单胞菌整合子与其多重耐药性之间的关系。1材料和方法1.1材料1.1.1菌株来源52009年10月～2010年5月从我院临床标本中分离的铜绿假单胞菌158株。标本分别来自老年病房(53株)、呼吸科病房（49株）、普外科病房(28株)、泌尿科病房(16株)和内分泌病房(12株)。菌株分别分离自痰标本（68株）、脓汁(42株)、咽拭子(18株)、尿标本(12株)、伤口分泌物（10株）和血液（8株）。标准质控菌株为铜绿假单胞菌（ATCC27853）。携带1型整合子铜绿假单胞菌为本实验室分离株经测序证实，作为PCR实验阳性对照。1.1.2鉴定

4、卡片全自动微生物分析仪(VITEK-AMS)采用的GNI鉴定卡、GNS药敏卡均购自法国Biomerievx公司,GNS药敏卡包括氨苄青霉素、庆大霉素、环丙沙星、阿莫西林/克拉维酸、头孢他啶、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、丁胺卡那、复方新诺明、头孢噻肟、亚胺培南11种抗菌药物职称论文。1.1.3PCR试剂TaqDNA聚合酶,4种dNTP混合液,DNA分子标准参照物购自Takara公司;琼脂糖,溴化乙啶等常用分子生物学试剂购自上海生工公司。1.1.4主要仪器VITEK-AMS自动鉴定系统购自法国Biomerievx公司;PCR扩增仪、DNA/RNA/proteinanalyzer分析仪和高速低温离

5、心机购自德国eppendorf公司;PCR电泳仪为北京崇文东方仪器厂产品;DGW-99型台式高速微型离心机为宁波新芝科器研究所产品。1.2实验方法1.2.1菌株鉴定所有菌株都用VITEKAMS分析仪GNI细菌鉴定卡进行菌种鉴定。体外药物敏感试验：采用GNS检测卡测定13种抗菌药物对158株铜绿假单胞菌的MIC值，操作方法按照VITEKAMS规定的方法进行。1.2.2加热裂解法制备DNA模板:用Luria-Bertani液体培养基200r/min振荡培养8h获得对数生长期菌株。携带1型整合子铜绿假单胞菌为本实验室分离株经测序证实，作为PCR实验阳性对照。1.2.3筛选1型整合子阳性菌株用PCR方

6、法扩增整合子可变区，以整合子上游引物ggcatccaagcagcaagc和整合子可变区下游引物aagcagacttgacctgat，进行PCR扩增。50ulPCR反应体系为:DNA100ng、25mmol/LMgCl2、0.4mmol/LdNTP、0.4pmol/L引物和2.5UTaq酶。PCR反应循环参数设置如下94℃预变性4分钟；94℃45秒，55℃，45秒，72℃53分钟，循环35次；最后72℃延伸10分钟。1.2.4PCR反应结束后取产物琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外灯下拍照记录结果。1.2.5统计学处理采用χ2检验，P＜0.05有显著差异。统计软件为SPSS10.0。2结果2.11类整合

7、子基因检测结果全部158株铜绿假单胞菌的DNA上有42株检测到I类整合子，占细菌总数的26.6%。1类整合子的大小分别为600bp、1000bp、1600bp、1900bp和2100bp。根据各株细菌质粒DNA上检测到1类整合子的大小和数目，细菌质粒NDA上的整合子可分为5种整合子谱。2.21类整合子阳性菌株与耐药性的关系对比1类整合子阳性菌株与阴性菌株对抗菌药物的耐药率，并做统计分析，结果见表1