western blot整理版

《western blot整理版》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、一、试剂配制1、RIPA裂解体系：150mmoL/LNaCl；1.0%NP-40或Triton-x-100；0.5%脱氧胆酸钠；0.1%SDS；50mmoL/LTris(ph8.0)2、蛋白电泳上样缓冲液（5×）：0.5MTris-HCl(pH6.8)2.5ml；甘油5ml；10%SDS4ml；1%溴酚蓝0.4ml；双蒸水7.1ml；混匀后950ul/管分装，-20度储存。用前加50ulβ-巯基乙醇/管。3、1.5MTris-HCl(pH8.8):配制150ml，4度储存。称取27.23gTrisbase溶于80ml双蒸水中，慢慢加浓盐酸调节pH至8.8（约

2、5ml），加双蒸水定容至150ml。4、1MTris-HCl(pH6.8)：配制100ml，4度储存。称取12.14gTrisbase溶于60ml双蒸水中，慢慢加浓盐酸调节pH至6.8（约3ml），加双蒸水定容至100ml。5、0.5MTris-HCl(pH6.8)：配制100ml，4度储存。称取6gTrisbase溶于60ml双蒸水中，慢慢加浓盐酸调节pH至6.8（约3ml），加双蒸水定容至100ml。6、10%SDS（w/v）：配制100ml，室温放置。称取10gSDS溶于80ml双蒸水中，最后定容至100ml。7、10%过硫酸铵（APS）:配制10ml

3、，-20度储存。称取1gAPS溶于8ml双蒸水中，最后定容至10ml。1ml/管分装保存。备注：10%过硫酸铵最好现配现用，配好的溶液在4度可保存2周左右，过期会失去催化作用。8、蛋白电泳缓冲液（5×）：Tris15g+甘氨酸94g+SDS5g+H2O至1L,临用时稀释5倍至1×SDS电泳缓冲液加入电泳槽中。注意：加水时要让水沿着壁缓慢流下，以避免由于SDS的原因产生许多泡沫。9、转印缓冲液（5×）:Tris15g+甘氨酸72g加水定容到1000ml,一般不需调节PH值,用时稀释5倍到1×转印缓冲液。如果采用PVDF膜或NC膜加20%甲醇。10、漂洗液(PB

4、S-T):取一包PBS粉剂配置成2L的溶液,然后加入0.05%或者0.1%Tween-20即可。11、封闭液:5%的脱脂牛奶粉PBS-T12、抗体稀释液：含5%BSAPBST溶液。二、WesternBlotting基本操作步骤1、蛋白样品的制备（培养细胞蛋白样品的制备）（1）收集细胞，用PBS洗两遍（300g；5min）后，视细胞量加入一定体积的RIPA裂解液，冰上裂解40min。（2）最大转速，4℃离心10min，收集裂解上清。转移到新的1.5mlEP管中。（3）测定蛋白浓度：选用Braford蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度Bradford法:检测原理:Bra

5、dford与蛋白质四级结构,特殊氨基酸结合,由棕色变成蓝色,595nm检测.该方法用于大多数蛋白质的定量是比较精确的,但不使用于小分子碱性多肽的定量,如核糖核酸酶或溶菌酶,去污剂的浓度超过0.2%影响测定结果,如TritonX-100,SDS,NP-40等.（4）在收集的上清中加入适量的蛋白上样buffer，沸水中煮5min。（5）将煮过的蛋白样品在最大转速，4℃条件下离心10min。（6）收集离心上清于新的1.5mlEP管中，并按60ug/管分装到PCR管中。制备好的蛋白样品置于-80℃保存，可延缓蛋白降解。2、SDS-PAGE胶的制备（1）洗板，烘干。（

6、2）将玻璃板架到制胶架上。（3）配制合适浓度的分离胶（下层胶）。备注：视蛋白分子量大小选择相应浓度的分离胶。不同浓度SDS-PAGE胶的配方见下图：（4）将配制好的分离胶加入两块玻璃板之间，加入量距上层边缘1cm-1.5cm左右（加入玻璃板的2/3左右）。上层添加异丙醇以压平液面和封胶。备注：一般一块凝胶需要配制分离胶5ml。（5）静置30min后，弃掉上层的异丙醇，并用自来水冲洗玻璃板，进一步清除异丙醇，最后用吸水纸将残留的自来水吸干。（6）准备梳齿，配制上层胶（浓缩胶）。备注：一般一块凝胶需要配制浓缩胶1-1.5ml。（7）将配制好的浓缩胶加到分离胶的上

7、面，加满玻片层，然后插入梳齿，注意不要有气泡。（8）静置30-40min，待凝胶完全凝集后便可上样电泳。3、上样电泳一般我们蛋白的上样量为60ug/孔。上样电泳时注意设置阳性对照和阴性对照。注意加样时间要尽量短，以免样品扩散，为避免边缘效应，可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液。电泳电压一般是80V跑半小时（以便蛋白在浓缩胶中缓慢浓缩），然后120V跑1h左右。观察样品跑的状态，一般称一条水平直线为好。视marker跑的状态，一般所要的蛋白对应的分子量跑至距凝胶上方2/3处即可停止电泳。4、转膜说明：一般在跑电泳时就将膜和滤纸准备好，泡于转膜缓冲液中了。在我

8、们的实验中，均是使用PVDF膜。将PVDF膜先在甲醇