氯化钙法质粒转化.doc

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1、氯化钙法进行质粒转化利用冰冷的CaCl2制备competentcells,以传统方法进行质体的转形。仪器用具：37℃培养箱；42℃水浴；冰浴药品试剂：0.1MCaCl2置冰浴中2Mglucose：取18gglucose溶于水中，并调体积至50mL，无菌过滤，分装后置-20℃贮存。2MMg2+：取20.3gMgCl2·6H2O及24.65gMgSO4·7H2O溶于水中，并调体积至100mL，无菌过滤的，分装小瓶置-20℃贮存。亦可以MgCl2完全取代MgSO4.SOB液体培养基：32MethodsinBiotechnologyVol12%Bactotrypt

2、one,0.5%yeastextract,10mMNaCl,2.5mMKCl,高压灭菌，使用前加入2MMg2+，使最终浓度为10mM.SOB固体培养基：2%Bactotryptone,0.5%yeastextract,10mMNaCl,2.5mMKCl,1.5%Bactoagar,高压灭菌，倒plate前加入2MMg2+使最终浓度为10mM.SOC/Amp固体培养基：SOB中另外添加20mMglucose及100μg/mLampicillin.SOC液体培养基：SOB中加入20mMglucose（使用前加入）。大肠杆菌菌株：JM109#1~#5接合反应液方

3、法步骤：1）进行转形实验前16~20h,自-70℃取出贮存的菌种，以划单一菌落方式将菌株JM109接种在SOB固体培养基上，在37℃培养。2）取40mLSOB培养基装入125mL已灭过菌的三角瓶（请记得加入Mg2+）。另取1mLSOB加于微量离心管中。由SOB固体培养基上选4~6个约2~3mm大小的单一菌落接入1mLSOB中，震荡将菌体打散后，加入40mLSOB中，于37℃震荡培养约2~3h,直至细胞数约为4~7×107/mL.可于接菌2h后每隔20~30min测A600估计3）收集菌液于离心管中，置冰浴中10~15min.4）以750~1,000g离心1

4、2~15min（4℃）。5）倒去上清，并尽量将液体倒干，或以微量移液器头吸干净。6）沉淀加入1/3菌液体积冰冷的0.1MCaCl2,稍加震荡，混合均匀，置冰浴中10~15min.7）同上4），5）的操作。再重复6），4），5）的操作，以使反应更完全，增加成功率。8）加入1/25菌液体积冰冷的0.1MCaCl2，稍加震荡使混合均匀。◆Competentcells制备完成！9）DNA样品（<10μL）先装于微量离心管中，置冰浴中预冷，另取一微量离心管，标上#0,不加入任何DNA（作为negativecontrol），亦置冰浴中预冷。每个样品加入200μL菌液，

5、震荡混合后，置冰浴中20~40min.10）42℃加热90s（温度及时间均需很准确，请事先检查水浴锅的温度，不可超过42℃）。◆Heatshock!11）置冰浴中2min。12）加入800μLSOC，混合后，于37℃震荡培养30~60min.13）将各管转形液上下摇动混合均匀后。#5取20μL至另一离心管中，加入180μLSOC（稀释10倍），混合均匀后，涂布于SOC/Ampplate.#0,#1~#4各取200μL涂抹在SOC/Ampplate.剩余菌液以6,000rpm离心1min,倒去上清，沉淀加入200μLSOC，均匀打散后涂抹在另一个SOC/Am

6、pplate上。14）待培养基表面的菌液完全被吸收后，倒置培养皿于37℃培养16~20h后，观察各个plate上菌落的形状并计算菌落数。实验九质粒DNA的转化【原理】转化是将外源DNA分子导入到受体细胞，使之获得新的遗传特性的一种方法。转化所用的受体细胞一般是限制-修饰系统缺陷变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶（R-，M-）。将对数生长期的细菌（受体细胞）经理化方法处理后，细胞膜、的通透性发生暂时性改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞。进入受体细胞的DNA分子通过复制和表达实现信息的转移，使受体细胞具有了新的遗传性状。将经过转化的细胞在筛选培养

7、基上培养，即可筛选出转化子（带有异源DNA分子的细胞）。本实验采用CaCl2法制备感受态细胞。其原理是细胞处于0～4℃，CaCl2低渗溶液中，大肠杆菌细胞膨胀成球状。转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃90秒热激处理，促进细胞吸收DNA得合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型，如氨苄青霉素耐药（Ampr）得到表达，然后将此细菌培养物涂在含Amp的选择性培养基上，倒置培养过夜，即可获得细菌菌落。本实验是将人Bcl-2重组质粒转化DH5α扩增菌，转化后在含Amp的培养基上进行筛选

8、，生长的菌落即为含重组质粒的工程菌。含人Bcl-2重组质粒的DH5