质粒的转化

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1、质粒的转化实验原理转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R-,M-)，它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法(如电击法、CaCl2、RbCl等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenentcells)。进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新

2、的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant，即带有异源DNA分子的受体细胞)。实验材料和试剂实验材料：已制备好的E.coliDH5α感受态细胞。实验试剂：含Amp的LB固体培养基：将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右，加入Amp储存液，使终浓度为50μg/mL，摇匀后铺板；Amp母液。 实验仪器第3页共3页质粒的转化-70℃冰箱实验步骤从-70℃冰箱中取200μL感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置冰上。加入pBS质粒DNA溶液（含量不超过50ng，体积不超过10μL），轻轻摇匀，冰上放置30min。42℃水浴中热击90s

3、或37℃水浴5min，热击后迅速置于冰上冷却3-5min。向管中加入1mL LB液体培养基（不含Amp），混匀后37℃振荡培养1h，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因（Ampr）。将上述菌液摇匀后取100μL涂布于含Amp的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24h。 对照　          对照组1:以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。第3页共3页质粒的转化           对照组2:以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5μl菌液涂布

4、于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。实验注意事项        本实验方法也适用于其它E.coli受体菌株的不同的质粒DNA的转化，但它们的转化效率并不一定一样。有的转化效率高，需将转化液进行多梯度稀释涂板才能得到单菌落平板，而有的转化效率低，涂板时必须将菌液浓缩(如离心)，才能较准确的计算转化率。第3页共3页