l缬氨酸合成代谢流量分析

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1、万方数据20卷3期2004年5月生物工程学报C^in邪e如“m口fo，B幻￡∞^，10209yL．缬氨酸合成的代谢流量分析李秀敏1李乃强2杨毅1姜绪林1邱勇隽2张星元H1(江南大学工业生物技术教育部重点实验室，无锡214036)2(上海凯赛研发中心有限公司，上海201203)V01．20No．3Mav2004摘要分别测定谷氨酸棒杆菌(co可w6w把一“m∥Ⅲnm站um)Asl．495及其3个逐个叠加不同遗传标记的突变株AA36l、AA他31和AAlT、r34l在特定培养时段(26—28h)L缬氨酸等代谢物的胞外浓度，由此计算这一时段这些代谢物在发酵液中积累(或消耗)的速率

2、，分别做出这4株菌在拟稳态下的代谢流量分布图，进而研究育种过程中不同遗传标记的叠加对代谢网络中L广缬氨酸合成流量分布的影响。结果表明遗传标记的引入使流量分配发生了重大变化，节点处的流量分配朝着有利于L缬氨酸合成的方向改变。6．磷酸葡萄糖节点处流人EMP途径和HMP途径的流量分配由17．O：83．0变为24．3：75．7；丙酮酸节点处流入L缬氨酸合成途径和其他途径的流量分配由15．8：84．2变为76．7：23．3。L广缬氨酸合成的分支途径上的流量由最初的5．37增大为37．3，乳酸合成途径的流量从11．1最后降为1．16，L一缬氨酸产量由4g，L提高到24．5∥L。代谢流

3、量分布的变化趋势与L缬氨酸产量的变化趋势是互相吻合的。以2一噻唑丙氨酸抗性突变(2．TA‘)和L广天冬氨酸氧肟酸盐超敏性突变(LAAH”)有效地进行代谢流遗传导向的事实，在代谢流量分析的层面上，证明结构类似物抗性突变和结构类似物超敏性突变是代谢流导向和设计育种的十分有效的手段，代谢流量分析会成为设计育种的校正方法。关键词I，缬氨酸，谷氨酸棒杆菌，代谢流量分析中图分类号Q933，Q935文献标识码A文章编号1000一3061(2004)03．0403．05我国到目前为止，多采用随机诱变和定向筛选的方法进行L．缬氨酸育种u’21，国外在80年代开始采用基因工程手段进行L．缬氨

4、酸育种⋯1。1991年Bailey。31等正式提出代谢工程的概念，随着代谢工程和分子生物学的发展，开始把它们结合起来进行L．缬氨酸育种。德国的EvaRadmacher等人¨1采用分子生物学手段，过量表达i如删cD基因，使iM和pnn日c基因缺失，得到的工程菌可积累缬氨酸119／L。代谢流量分析(metabolicnuxanalvsis)是一种研究胞内代谢的方法，根据胞内主要反应的化学计量模型和胞内代谢产物的质量平衡来计算胞内的代谢流量。这种分析方法的基础是拟稳态假设：假设在产物形成速率最快的阶段各种中间代谢物的胞内浓度变化速率为0。根据质量平衡，由n个中间代谢物即可得到n

5、个关于速率的方程，通过测定胞外代谢产物的浓度，计算未知途径的流量b’6’7]。本文通过对菌种选育过程中所得到的不同突变株发酵过程的研究，测定遗传标记不同的4株菌Asl．495及其突变株AA361、AA他31和AATv341在L．缬氨酸形成阶段的相关代谢物的胞外浓度，得到它们在L．缬氨酸形成阶段的代谢流量分布图，并对它们的代谢流量分布进行比较和分析，研究了育种过程中遗传标记的叠加对L．缬氨酸合成网络中流量分布的影响。1材料与方法1．1实验材料谷氨酸棒杆菌Asl．495(Leu一)，由中国微生物菌种保藏中心提供。突变株AA361(ku一，L．AAH”)、AAT231(Leu。

6、，L．AAH”，2．TA。)和AATV34l(ku一，L-AAH”，2．TA。，Vd’)，它们分别是谷氨酸棒杆菌Asl．495(ku一)依次叠加L_天冬氨酸氧肟酸盐超敏(L．AAH88)、2．噻唑丙氨酸抗性(2．TA。)和缬氨酸降解途径缺损(Vd一)等遗传标记所得的突变株，由本实验室提供。1．2培养基1．2．1斜面培养基(g／L)：牛肉膏30、蛋白胨10、氯收稿日期：2003。lO．29，修回日期：2004．01．29。*通讯作者。Tel：86—5lO-5879480；F“：86-5lO-580“93；E．mil：biozh¨g@163．com万方数据生物工程学报20卷化

7、钠5、琼脂条20，pH7．0，0．1MPa下灭菌20min。1．2．2种子培养基(g／L)：葡萄糖40、尿素3、KH2P041．5、K2HPO。0．5、MgSO。·7H：O0．5、蛋白胨20、酵母浸出膏5，pH7．0，0．1MPa下灭菌20min。1．2．3摇瓶发酵培养基(g／L)：葡萄糖90、(NH4)：’S0。40、KH2P041、MgSO。’7H：O0．5、FeS04。7H200．002、Mns04·H200．002、生物素5×10_1、VBl5×10一、豆饼水解液20；CaC0350，pH7．2，0．1MPa下灭菌20