第四组SDS-PAGE测定酶.ppt

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1、SDS-PAGE测定酶目录一、实训目的二、实训原理三、实训材料四、实训步骤一、实训目的掌握SDS-PAGE电泳技术的原理、凝胶配制等知识能够熟练进行加样能够正确使用电泳仪二、实训原理1.SDS-PAGE分离样品的主要依据是各种物质分子量的差异性。当SDS与各种酶分子结合后，酶分子即带有大量的负电荷，并远远超过了其原来的电荷。因此在电泳时，电泳迁移仅取决于分子量大小而与其所带的电荷无关。三、实训材料1.试剂30％丙烯酰胺溶液(Acrylamide-Bis)配置100mL:29克丙烯酰胺，1克甲叉双丙烯酰胺，置于25

2、0mL烧杯中，向烧杯中加入约80mL的去离子水，充分搅拌溶解，最后定溶100mL，置于棕色瓶4℃保存。0.5moL/L浓缩胶缓冲液配置100mL：6.0克Tris，置于100mL烧杯中，加80mL去离子水搅拌溶解；用HCl调节pH值到6.8，加水混匀定容至100mL。1.5moL/L分离胶缓冲液配置100mL:18.2克Tris、置于100mL烧杯中，加80mL去离子水搅拌溶解；用HCl调节pH值到8.8，加水混匀定容至100mL。5xTris-甘氨酸电极缓冲液组分浓度0.125moL/LTris，1.25moL

3、/LGlycine,0.5%(m/v)SDS；配置1L：15.1克Tris，94克甘氨酸、5克SDS，加水混匀定容至1L，室温保存10％（m/v）过硫酸铵配置10mL：1克过硫酸铵溶于l0ml蒸馏水中，临用前配制。10％（m/v）SDS配置10mL:配置方法同过硫酸铵2x样品处理液组分100mmol/LTris-HCl（Ph6.8），4%（m/v）SDS,0.2％（m/v）溴酚兰,20%（体积倍数）甘油，2%（m/v）β-巯基乙醇；配置量5mL：取1mol/LTris-HCl（Ph6.8）0.5mL，SDS0.2

4、g，溴酚蓝10mg，甘油1mL，加水溶解定溶至5mL。小份分装，0.5mL一管，室温保存。使用前将25μL的β-巯基乙醇加入混匀考马斯亮蓝染色液配置量1000mL：称取0.125%考马斯亮兰R-2501.25g，250mL甲醇或乙醇，80mL乙酸，加蒸馏水补足1000mL。充分混匀后进行过滤，收集滤液备用。脱色液7％醋酸蛋白质样品46kda的酶其他试剂15g/L琼脂糖溶液（封胶用）（用1xTris-甘氨酸电极缓冲液配置）2.仪器1.电泳仪2.电泳槽及灌胶模具3.电炉4.微量移液器5.烧杯、量筒、摇床等四、实训步骤

5、1.准备工作将垂直板型电泳装置的玻璃片洗干净，晾干，嵌入凹槽中，夹好。将电泳槽、凝胶模子串成一体的垂直板型电泳装置，垂直放置在水平台面上。2.分离胶的制备按比例取试剂立即混匀，将混合液，迅速在电泳槽的两玻璃板之间灌注，留出灌注浓缩胶所需空间（梳子的齿长再加0.5~1cm）。用滴管小心地在溶液上覆盖一层蒸馏水，以隔绝空气中的氧气，并使胶面平整。将电泳槽垂直静置于室温约1h或更长，待分离胶聚合完全后（水封层和凝胶面之间会出现明显的水胶分界线），倾出覆盖的水，再用滤纸吸净残留水（注意勿将滤纸碰到胶面）。准备灌注浓缩胶。

6、3.浓缩胶的制备在聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶，立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子，梳底距离分离胶至少有0.5~1cm。4.样品的处理在待测酶样品中按1:1体积比加入2倍样品处理液，在100℃沸水中加热3~5min以使酶变性。另外选择相对分子量大小合适的标准蛋白质作为参照，并做同样处理。5.加样待浓缩胶完全聚合后，小心移出梳齿，用电极缓冲液洗涤加样孔数次，然后将凝胶固定于电泳装置上，槽中加入Tris-甘氨酸电极缓冲溶液。必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡。用微量注射器向凝胶梳孔内加样，动作轻缓、准确、迅速，防止

7、窜孔。6.电泳接上电泳仪，上电极接电源的负极，下电极接电源的正极。电泳时，调节电流至20~30mA并保持电流强度恒定。待蓝色的溴酚蓝条带迁移至距离凝胶下端约1cm时，关闭电源停止电泳。7.剥胶电泳结束后小心从电泳装置上卸下玻璃板，将胶取出，注意凝胶的完整性。8.染色和脱色经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的酶样品可用考马斯亮蓝R250染色。将凝胶完全浸入固定染色液中放摇床上，轻轻摇动使染色均匀，染色1~2h或过夜，至显出条带。染液收回，用水洗去凝胶表面染液，加脱色液脱色，需3~10小时，期间更换多次洗色液至背景无色

8、。9.凝胶保存可用7%醋酸或20%甘油保存，也可拍照、扫描或脱水制成干胶保存。10、相对分子质量的计算10、相对分子质量的计算（1）电泳相对迁移率的计算用直尺分别量出标准蛋白质、待测酶区带中心以及溴酚蓝距分离胶顶端的距离，按以下公式计算相对迁移率：（2）标准曲线绘制以各标准蛋白样品的相对迁移率为横坐标，其相对分子质量（Mr）的对数值为纵坐标，在坐标纸上作图，可拟合绘制一条