二、DNA和RNA的制备说课讲解.ppt

《二、DNA和RNA的制备说课讲解.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、二、DNA和RNA的制备一、DNA在生物体中的存在形式1．染色体DNA：生物体遗传信息的主要载体*原核生物染色体：结构简单，储存的信息相对较少*真核生物染色体：结构复杂，储存大量的遗传信息用途：分离目的基因，研究基因的调控与表达2．病毒和噬菌体DNA构建克隆载体，分离目的基因3．质粒(Plasmid)DNA（染色体外遗传物质）特点：能自我复制，大小不一，在体内以超螺旋形式存在，在体外以超螺旋、开环和线形存在。用途：构建克隆载体，分离目的基因4．叶绿体和线粒体DNA构建克隆载体，分离目的基因二、天然DNA的提取

2、1.准备生物材料：选取的材料－－提取DNA得率最高的生长期，或是DNA容易提取或含量高的组织细菌－－对数生长期后期植物－－幼嫩组织、暗培养1－2天肝脏－－清除胆囊（含高活性的酶）2.裂解细胞:原核生物－－溶菌酶，NaOH/SDS，煮沸，冰冻，超声波动、植物－－粉碎3.分离和抽提DNA:1）提取总DNA加蛋白质变性剂2）提取叶绿体或线粒体等细胞器的DNA、病毒和噬菌体DNA：先需要分离出完整的细胞器、病毒和噬菌体，提取DNA之前还需DNase处理，水解其它的DNA3）提取质粒DNA：使其与染色体DNA分开调节细

3、胞裂解液的pH值达到12.6再调节pH值至中性所有DNA变性沉淀质粒DNA复性后从沉淀中释放出(一)、细菌总DNA的制备(Escherichiacoli)1.菌体培养:将活化的菌体接种于LB(Luria-Bertani)培养基，于37ºC培养至对数生长期,然后置冰水浴20min2.收集菌体:离心(5000g,5min)(50ml)3.菌体裂解:加5ml冷TES(0.1MTris-HCl，0.1MEDTA，0.15MNaCl,pH8.0)加10mg溶菌酶,于37ºC温育10min4.去RNA:加入1mgRNas

4、e于50ºC温育15min5.去蛋白:加入0.6ml、10%SDS和ProteaseK(0.1mg/ml)，60ºC、30min；加苯酚-氯仿抽提(等体积)6.沉淀DNA:加入1/10V的NaAc，2V无水乙醇；以玻璃棒缠绕絮状沉淀，溶于TEBuffer中(二)、细菌质粒DNA的制备常用的碱法、煮沸法、SDS等均可；选择何种方法制备质粒DNA，视不同的菌株和不同大小的质粒DNA分子以及以后进行的不同实验等具体情况而定：菌株类型：如大量提取HB101、TG1菌株中的质粒，不宜用煮沸法；质粒的大小：大于15k

5、b的质粒DNA易被强烈的物理或化学作用破坏，所以常选用操作过程较温和的SDS法，细菌悬浮液中含有10%的蔗糖以提高溶液的渗透压，减轻细菌裂解时DNA泄漏过快产生的机械剪切力。细菌染色体DNA变性条件强弱的控制：碱法是最常用的质粒DNA提取方法，它对细菌的裂解，细菌染色体DNA及蛋白质变性充分，所以提取的质粒DNA产量高、纯度好。碱裂解变性法：1.菌体培养：将活化的菌体接种于含一定浓度抗生素的LB培养基中，于37C培养至对数生长期后期，然后置冰水浴20min。1)常用的抗生素及其使用浓度氨苄青霉素：（Amp

6、ericillin,Ap）50-150μg/ml链霉素：（Streptamycin,Sm）25-50μg/ml四环素：（Tetracycline,Tc）10-50μg/ml氯霉素：（Chlorampenicol,Cm）20-170μg/ml卡那霉素：（Kanamycin,Km）25-50μg/ml2)常用的质粒载体及其起始复制序列（复制子）质粒起始复制序列拷贝数pBR322pMB115-20pUCpMB1500-700pACYCp15A10-12pSC101pSC1015COLE1COLE115-203)质粒

7、的相关概念严谨型质粒：质粒（如pSC101）的复制依赖于宿主细胞提供的蛋白和质粒自身编码的蛋白的共同作用。松弛型质粒：质粒（如pUC系列）的复制并不需要质粒编码的功能蛋白，而是完全依赖于由宿主提供的半衰期较长的酶，当蛋白的合成停止时，复制仍然进行。拷贝数：质粒在细胞内存在的数量。如果待提取的质粒属于松弛型复制的质粒，可在扩大培养3-4h后，培养液中加入Cm(终浓度150-170μg/ml)，继续培养10h作用，可以达到质粒扩增的目的。？Cm严重超标：乳品、猪肉、水产品等2．收集菌体离心(5000g，5min)

8、3．细胞裂解DNA变性：悬浮于冰预冷的含葡萄糖的TE缓冲液中加入裂解缓冲液(1%SDS,0.2MNaOH)4．质粒DNA选择复性加入1/10V浓度为3mol/LNaAc(pH4.8)5.去蛋白以等体积的苯酚-氯仿抽提6．DNA的沉淀加入2V的无水乙醇，室温30min，离心(12000g，15min)，沉淀以70%乙醇洗涤7．沉淀溶TEbuffer中SDS：分离DNA时常用的一种阴离子去垢剂，有4种作