科研基本训练1课件

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1、研究生科研基本训练——常用实验基本技术生物医学研究常用基本技术分子克隆技术（DNA重组技术）免疫印迹技术（Westernblot）免疫组织化学技术（免疫组化）细胞培养技术局限性联合应用分子克隆技术DNA体外重组技术：是在分子水平上，根据人们的需要以人工的方法将感兴趣的目的基因，在体外与载体DNA分子重组，然后将重组子转入受体细胞，并筛选出表达重组DNA的活细胞，加以纯化、扩增、成为克隆，这一过程称为DNA体外重组技术。基本过程分、切、连、转、筛1.分：分离出要克隆的目的基因及载体。①目的基因的来源：直接分离适于

2、遗传背景了解比较清楚的细菌染色体、质粒及病毒DNA的提取分离。首先通过组建几种限制性内切酶的物理图谱进行基因定位，然后用DNA的酶切片段电泳分离DNA，应用相应DNA探针确定目的DNA后，从胶中回收DNA。(适合原核)人工合成序列明确的短DNA片段，可用DNA合成仪合成（适合较短的）。由mRNA逆转录合成cDNA细胞总RNA分离mRNA分离目的基因mRNA的纯化cDNA第一链的合成cDNA第二链的合成cDNA的克隆（格外注意基因表达时空特异性）从基因组文库中筛选目的基因首先构建基因组文库（G文库）或cDNA文库

3、（C文库），需要时利用探针技术将所需目的基因“钓”出来。②载体：可容忍外源性DNA片段插入，可在细胞间转移并能在细胞内自主复制的DNA分子。理想的质粒克隆载体应具有的特性：能在宿主细胞中独立复制，并能携带DNA片段一同扩增具有多种常用的限制性内切酶的单酶切位点,即多克隆位点(MCS,multiplecloningsites)，便于进行克隆分子量小，可插入较大的外源DNA而不影响复制易于导入受体细胞具有容易操作的检测表型。如抗生素抗性、α-互补显色反应（蓝白斑筛选）表达型载体应配备与宿主细胞相适应的启动子，前导序

4、列，增强子等调控元件生物安全性好目前常用的载体有质粒、噬箘体、病毒等。载体2.切：用限制性内切酶切割目的基因和载体，使其产生便于连接的末端。3.连：将切割后的目的基因和载体用T4DNA连接酶连接。4.转：把连接好的重组载体转化入感受态细胞的过程（细菌：E.coli，真菌：Yeast，昆虫细胞或哺乳动物细胞）。5.筛：在不同层次上、不同水平上进行筛选，鉴定所需的特异性重组子。使用各种方法，将带有重组载体的宿主菌从培养基中筛选出来。例如：载体大小，酶切结果，筛选标记等。RNA的提取和cDNA合成聚合酶链式反应(PC

5、R)扩增目的片段质粒DNA的分离、纯化和鉴定质粒、PCR产物的酶切重组DNA的连接重组质粒的转化及筛选凝胶电泳测序技术DNA体外重组技术总RNA制备Trizol法:主要用途：总RNA提取（DNA、蛋白质提取）主要成分：苯酚、异硫氰酸胍等适用组织：人类、动物、植物、微生物的组织，细菌或真菌样品量：从几十毫克至几克。用Trizol法提取的总RNA无蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern斑点分析，斑点杂交，Poly(A)+分离，体外翻译，RNase封阻分析和分子克隆。InvitrogenTRIzol®产品

6、RNA提取试剂盒：国产、进口常用总RNA提取试剂盒尽量选用含DNA酶的试剂盒Trizol法提取总RNA步骤以50-100mg组织加入1mlTrizol液研磨，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。研磨液室温放置5分钟，然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒，静置3分钟。取上层水相于一新的离心管，按每1mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟，12000g离心10分钟。弃去上清液，按每1mlTrizol液加入至少1

7、ml的比例加入75%乙醇，涡旋混匀，4℃下7500g离心5分钟。小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于水中，必要时可55℃-60℃水溶10分钟。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。Tips：样品收集后迅速放入液氮；样品在Trizol溶液中相对稳定；注意避免RNase，尤其是内源的；丰度低的mRNA：实验所需的耗材需要0.1%DEPC水处理，高压灭菌丰度中等以上的mRNA：耗材高压灭菌即可。获得高纯度RNA，要懂得取舍

8、；上清取适量即可（500ul）。完全干燥的RNA溶解度极低；完全干燥的RNA呈透明状；趁RNA沉淀仍然呈白色的时加水溶解RNA样品相关实验要尽快进行，如需保存RNA，需存于-80度超低温冰箱；避免RNA酶污染由于RNA分子容易受RNA酶的攻击反应而降解,加上RNA酶极为稳定且广泛存在,因而在提取过程中要严格防止RNA酶的污染,并设法抑制其活性,这是本实验成败的关键。在cDNA生成之前，