提高植酸酶热稳定性的技术途径及产品评测方法.docx

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1、提高植酸酶热稳定性的技术途径及产品评测方法制粒是常用的饲料加工工艺，通过制粒改善饲料适口性，提高饲料利用率，保证动物均衡采食营养素和提高生长速度，同时在压制过程中实现高温杀菌。在制粒过程中，通常会通入一定压力的蒸汽，从而使粉料在进入环模制粒前达到较高的温度，即调质过程。粉料温度的测定点一般紧靠在调质器的出口处，这里测定的温度也就是通常所说的制粒温度，理想的制粒温度范围在80-90℃。而实际使用的蒸汽温度则远高于此，湿蒸汽、饱和蒸汽和过热蒸汽的温度分别可以达到100、140和160℃，同时粉料通过制粒机环模后温度也会因摩擦力而增加。此外，蒸汽调质时的高湿环境增强了热能的传递

2、。这些都对饲料中的热敏性因子，如植酸酶产生极大的破坏。制粒对植酸酶的破坏源于高温对其空间结构的破坏，目前饲料上应用的植酸酶大部分属于酸性磷酸酶家族，其空间上包含两个结构域，因植酸酶的菌种来源不同，其包含的α、β结构数量不一，如无花果曲霉植酸酶的结构是由一个较大的α、β结构域和一个小的α结构域组成，α、β结构域是由5个α螺旋和8个β折叠构成，α结构域是由4个α螺旋组成。而大肠杆菌植酸酶的两个结构域一个是由5个α螺旋和2个β折叠组成，另一个是由6个α螺旋和9个β折叠组成。植酸酶活性部位的氨基酸序列具有高度保守性，其间的氨基酸被修饰或突变后都会导致酶活性的丧失，但高温的影响则在

3、于去折叠效应。植酸酶目前已通过基因工程微生物发酵实现了大规模廉价生产，而今，生物工程技术也为解决植酸酶的热稳定性提供了很好的途径。同时研究发现，一些分子能通过化学修饰有效提高植酸酶的热稳定性。此外，新型包被技术和包被材料的应用进一步提高了植酸酶热稳定性。1、生物工程技术设计制造耐热植酸酶菌株自然界产生植酸酶的微生物多种多样，每种植酸酶的性质各不相同，自然界中存在的烟曲霉、淀粉液化芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等中分离到的植酸酶都能耐受高温，但都在37℃时酶活性极低，缺乏饲用价值（见表1）。来源最适温度℃热稳定性无花果曲霉58最高可以耐受65℃的高温烟曲霉70100℃下加热20mi

4、n后，酶活仅损失10%米曲霉5665℃时酶活损失80%淀粉液化芽孢杆菌6090℃处理10min后酶活可保留50%地衣芽孢杆菌6595℃处理15min后酶活可保留61%枯草芽孢杆菌5560℃处理1h，活性减少90%植酸酶的耐热性是受基因控制且可以遗传的。随着基因工程技术及分子生物学技术的发展，蛋白质工程法逐渐成为人们研究蛋白质稳定性的主要手段。目前在蛋白质热稳定性工程中常用的方法为：推理设计、同序概念、杂合酶和定向进化。推理设计主要是把热稳定蛋白与热不稳定蛋白的氨基酸序列进行比较，分析究竟是哪些氨基酸对蛋白质的热稳定性起关键作用。对耐热与常温植酸酶蛋白的研究发现二者分子量的

5、大小、亚基结构、螺旋程度、极性和活性中心都极相似，但耐热酶蛋白中亮氨酸、脯氨酸、谷氨酸和精氨酸含量均高于常温菌所产植酸酶，而胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷胺酰胺和天门冬氨酸含量显著低于常温酶蛋白。这是因为脯氨酸结构熵小而易折叠，且一经折叠后则需要很高的能量才能解开，从而提高蛋白质稳定性。谷氨酸和精氨酸分别比带同样电荷的氨基酸有更大的侧链，侧链所提供的疏水作用及离子间互相作用能提高蛋白质的稳定性。亮氨酸具有较强的疏水性和较大的侧链。目前通过基因定向突变，将植酸酶邻近活性中心的部分氨基酸突变为脯氨酸，已经成功的提高了植酸酶的热稳定性。由于脯氨酸易形成β折叠，从而使构象更稳定牢固，

6、在稳定蛋白质结构和提高酶热稳定性方面具有不可忽视的作用。同序概念是一种半推理的方法，是对一组同源蛋白质的氨基酸序列进行比较，以一定的标准程序计算各氨基酸序列，从中选择对每个氨基酸位点最保守的残基，拼成序列，然后将最后确定的氨基酸序列翻译成相应的碱基序列，最后选用合适的表达系统对这个“人造的”目的基因进行表达。该方法能减少有害突变，也不需要进行高通量的筛选，但设计过程难度较大。杂合酶技术是把来自不同酶分子的结构单元如二级结构、三级结构或功能域进行组合或交换以产生具有所需要性质的优化酶杂合体结构，组合出新酶。目前已经有技术将土曲霉来源的植酸酶表面的一个二级结构α螺旋用黑曲霉植

7、酸酶上相应长度的一段序列替换，获得了酶活性未变而热稳定性提高的新植酸酶。其原理是因为α螺旋中氨基酸改变导致疏水作用变化，增加了热稳定性。因对杂合的片段相似性要求高，杂合酶技术主要应用于对同源蛋白的稳定性加以改善。定向进化主要包括多轮随机突变和DNA改组技术。多轮随机突变是以目的基因进行第一轮随机突变，然后筛选出最佳突变子作为下一轮突变的亲本，如此循环下去获得性状优良的突变体。DNA改组技术是指DNA分子的体外重组，通过改变单一或多个基因原有的核苷酸序列，创造新基因，并赋予表达产物以新功能。实际上是一种分子水平上的定向进化，因此