elisa知识讲座之二

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1、ELISA知识讲座之二ELISA的原理和类型1.　ELISA的原理　　ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的

2、量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。2.　ELISA的类型　　ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂：（1）固相的抗菌素原或抗体，即"免疫吸附剂"（immunosorbent）；（2）酶标记的抗原或抗体，称为"结合物"（conjugate）；（3）酶反应的底物。根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法。用于临床检验的ELISA主要有以下几种类型：2.2.1　双抗体夹心法测抗原　　双抗体

3、夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：1）将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。2）加受检标本，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。　　洗涤除去其他未结合物质。3）加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合　　的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。4）加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色，测知标本中抗原的量。　　在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要获

4、得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。如抗体的来源为抗血清，包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物。如应用单克隆抗体，一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分别用于包被固相载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性，而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应，作一步检测。　　在一步法测定中，当标本中受检抗原的含量很高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成"夹心复合物"。类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象，此时反应后显色的吸光值（位于抗原过剩带上）与标准曲线（位于抗体过剩带上）某一抗原浓

5、度的吸光值相同（参见1.3.2，图1-4），如按常法测读，所得结果将低于实际的含量，这种现象被称为钩状效应（hookeffect），因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落。钩状效应严重时，反应甚至可不显色而出现假阴性结果。因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）时，应注意可测范围的最高值。用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应。　　假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇，例如HBsAg的a决定簇，也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物。但在HBsAg的检测中应注意亚型

6、问题，HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4个亚型，虽然每种亚型均有相同的a决定簇的反应性，这也是用单抗作夹心法应注意的问题。　　双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子（RF）的干扰。RF是一种自身抗体，多为IgM型，能和多种动物IgG的Fc段结合。用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF，它可充当抗原成份，同时与固相抗体和酶标抗体结合，表现出假阳性反应。采用F（ab'）或Fab片段作酶结合物的试剂，由于去除了Fc段，从而消除RF的干扰。双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响，已被列为这类试剂的一项考核指标（参见6.2）。　　双抗体

7、夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。2.2.2双抗原夹心法测抗体　　反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗HBs的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。2.2.3间接法测抗体　　间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体（抗人免疫球蛋白抗体）以检

8、测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法（见图2-3）。操作步骤如下：1）将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原。洗涤除