食品安全检验技术实验教程文件.ppt

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1、食品安全检验技术实验实验一蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药的生物化学法测定（综合型）实验二对虾中氯霉素含量的酶联免疫吸附试验法检测（技能型）实验三鱼体中组胺含量的分光光度法检测（技能型）实验四饮料中食用合成着色剂的测定（设计型）目录【实验目的】通过实验进一步掌握蔬菜中农药残留量生物化学法测定的基本原理和实验方法，比较两种常见的生物化学测定法，酶抑制率法和速测卡法的异同；培养学生综合运用理论知识，分析和解决问题的能力。实验一蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药的生物化学法测定【实验原理】生物化学测定方法根据其检测手段又可分为速测卡法和酶抑制率

2、法。速测卡法的原理是根据胆碱酯酶可催化靛酚乙酸酯（红色）水解为乙酸和靛酚（蓝色），有机磷或氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶有抑制作用，使催化水解、变色的过程发生改变，由此可判断出样品中是否含有有机磷或氨基甲酸酯类农药的存在。酶抑制率法的原理是在一定条件下，有机磷或氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶有抑制作用，其有抑制率与农药的浓度呈正相关。正常情况下酶催化乙酰胆碱水解生成胆碱，胆碱在显色剂的作用下产生黄色物质，该黄色在412nm处有特征吸收峰，用可见分光光度计或农药残毒快速检测仪进行测定。【实验步骤】1、速测卡法（纸片法）检测①滴2~3滴洗脱液在

3、菜叶正面近叶尖部分，用另一片菜叶滴叶处轻轻摩擦。②取一片速测卡，将菜叶上洗出的水滴1滴在白色药片上，静置10min。③将速测卡对折，用手捏3min。④打开速测卡，白色药片变蓝色为正常反应，不变蓝或显淡蓝色说明有过量有机磷或氨基甲酸酯类农药残留。每批同时做一片无农药对照。【实验步骤】2、酶抑制率法检测①取2g切碎样本，置提取瓶内，加入20mL提取试剂，震荡1~2min；倒出上清液，静置3~5min。于平底小试管中加入50μL酶液、3mL样品提取液、50μL显色剂，在37℃~38℃下培养30min。②于待测的小试管内加入50μL底物，倒

4、入比色杯内，进行仪器测定。同时做对照组（对照组的平底小试管中用3mL提取试剂代替样本提取液）。【注意事项】1、速测卡法检测中，当温度低于37℃时，酶反应的速度随之放慢，药片加液后放置反应的时间应相对延长。延长时间的确定，应以空白对照卡用手指捏3min时可以变蓝。2、速测卡法检测中，预反应后药片表面必须保持润湿。3、采用酶抑制率法测定韭菜、生姜、葱、蒜、辣椒、胡萝卜等蔬菜中农药时，不要剪得太碎，浸提时间不能太长，对于这类蔬菜必要时可采取整株浸提。一些叶绿素含量较高的蔬菜也是如此。4、当温度条件低于37℃时，加入酶液和显色剂后放置反应的

5、时间应适当延长，延长时间的确定应以胆碱酯酶空白对照测试3min的吸光度变化A0值在0.3以上，即可往下操作。5、当吸光度过大无法读取时，说明测定溶液浑浊有干扰。【实验目的】进一步学习酶联免疫试验法的基本原理和实验方法，确实掌握酶联免疫吸附试验法测定虾肉中氯霉素含量的基本原理、实验方法和结果的分析。实验二对虾中氯霉素含量的酶联免疫吸附试验法检测【实验原理】抗原与抗体能发生特异性的免疫化学反应。以竞争性酶联免疫反应为例：酶标记抗原与样品或标准体中的非标记抗原（氯霉素）具有相同的与抗体结合的能力，两者竞争与固相载体包被的抗体结合反应。洗涤

6、多余的酶标抗原，加酶反应的底物后，底物被酶催化显色，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。在整个反应当中，样品中氯霉素含量越多，反应显色就越淡。反之，样品中氯霉素含量越少，则显色越深。【实验步骤】1、实验准备①从冰箱取出试剂盒，将氯霉素标准溶液、浓缩萃取稀释液、浓缩洗涤液、酶标记物、底物溶液及微量测试孔条置于室温下回温30min。②配制原倍萃取稀释液及洗涤液：用蒸馏水将10倍浓缩萃取稀释液及浓缩洗涤液都分别用蒸馏水按1:9的比例稀释。【实验步骤】2、样品制备①将3g对虾肉剪碎后放入50mL带塞离心管中，加入6mL乙酸乙酯，用均质

7、机均质约1min，再震荡约30s。②离心（3000rpm，10min），取2mL上清液至玻璃管中，于50℃下氮气吹干。③于上述玻璃管中加入正己烷2mL，先将残余物完全溶解后，再加入1mL原倍萃取稀释液，震荡约30s。④离心（3000rpm，10min），用吸管吸去上层液及中间乳化层部分，弃掉，取下层液备用。【实验步骤】3、操作测定①取一定的微量测试孔条，于适当微孔中分别加入100μL标准溶液（六个浓度）。②在另外的微孔中加入100μL已完成前处理的样品溶液③在每一微孔中加入50μL酶标记物。④轻敲盘子四周，使其充分混合后于室温下避光

8、静置温育1h。⑤甩掉微孔中的反应液，再将洗液加满每一微孔后甩掉，重复洗3次，最后一次甩掉洗液后，在吸水纸上拍干。⑥于每一微孔中加入底物溶液100μL后，轻敲盘子四周，使其充分混合，室温下避光静置温育20min。⑦于每一微孔中加入100