姜黄素促进大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化中活性氧表达变化探究

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1、姜黄素促进大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化中活性氧表达变化探究　　[摘要]目的研究姜黄素对成年大鼠骨髓间充质干细胞（rBMSCs）的成骨性分化中活性氧（ROS）表达变化的影响。方法贴壁筛选法体外培养健康SPF级SD大鼠rBMSCs，分为四组，姜黄素组（15μmol/L姜黄素干预），N-乙酰半胱氨酸（NAC）组（含40mmol/LNAC），姜黄素+NAC组（含15μmol/L姜黄素+40mmol/LNAC），对照组（只含等体积溶剂）。比较各组间碱性磷酸酶（alkalinephosphatase，ALP）活性，骨钙素（boneglaprotein，BGP）含量和ROS相关蛋白表

2、达变化。结果①姜黄素组第4、8、12天ALP表达OD值[（35.72±0.295）、（60.44±0.347）、（51.51±0.487）]均高于对照组[（19.96±0.874）、（53.55±0.978）、（41.32±0.755）]，差异均有统计学意义（P　　各组在成骨性诱导培养的第4、8、12天进行ALP活性的检测。具体方法为：弃培养液，以PBS洗涤至少2次，在每孔中加入基质液和缓冲液各300μL混匀，在37℃的水浴锅水浴15min，加900μL的显色液，采用紫外分光光度计测定507nm处的OD值。最后根据酚标准以及各样本的OD值，计算ALP的活性，实验结果采用

3、每孔15min内产生的酚的摩尔量表示。61.4骨钙素（boneglaprotein，BGP）的检测在48孔板中每孔接种1×108/LMSCs细胞250μL培养24h后，每孔分别加入各实验组250μL含成骨性分化培养基，各培养液连续添加3d，每组样本为4份，在12d后收集培养液冻存于-80℃，采用大鼠的骨钙素放射免疫分析（IRMR）试剂盒进行骨钙素含量的检测。1.5Westernbloting蛋白检测将各实验组rBMSCs诱导成骨化培养8d后，弃培养液，采用4℃预冷的PBS漂洗至少2次后，加入500μL的细胞裂解液[细胞裂解液的组分为50mmol/LTris-HCl/pH

4、8.0、100mg/L苯甲基磺酰氟（PMSF）、150mmol/LNaCl、1%Tween-20、1mg/L抑蛋白酶肽、1%十二烷基磺酸钠（SDS）和0.5%去氧胆酸钠]于冰上静置至少30min，使得细胞裂解完全。于4℃、12000r/min，离心15min，取上清液，采用BCA法进行总蛋白浓度的定量检测；95℃变性4min，各组上样量均为50μg蛋白质样品，经过15%SDS-PAGE电泳分离后，将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF）膜上，采用5%的脱脂奶粉在室温下摇床振荡封闭2h，然后加入iNOS和β-actin的抗体（均为1∶1000稀释），4℃摇床振荡过夜；第2

5、天加辣根过氧化物酶标记的相应的二抗（1∶3000稀释），在37℃孵育2h；每进行下一步实验前，PVDF膜均用4℃预冷的TBST漂洗3次，每次10～156min；最后采用增强化学发光法检测相应的目的蛋白，灰度值用ImageJ软件分析，实验至少重复3次。1.6统计学方法采用统计软件SPSS13.0对数据进行分析，正态分布计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用Tukey法。以P　　[参考文献][1]JacobsSA，RoobrouckVD，VerfaillieCM，etal.Immunologicalcharacteristicsofhum

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