方红豆杉细胞态势及紫杉醇合成的影响

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1、万方数据万方数据张长平等:真菌诱导子对悬浮培养南方红且杉细胞态势及紫杉醇什成的影响0.1moi/L磷酸盐缓冲液配制而成的含有0.2mol/LEDTA,DTID.4mmol/l,的细胞提取液,低温(4℃)离心后取上清液为胞内待测液。1.5.1培养液pII的测定:采用PHS.2型精密酸度汁(上海雷磁仪表厂)测定。1.5.2细胞内总活性氧相对含量的测定:细胞经冷冻干燥后,取一定量细胞干粉用ESR—SPECTROME—TER检测其顺磁共振图谱,以MnO,为标准校准磁场。测定条件为:微波功率,1mW;扫场时间8min/360mm;调制幅度2G;响应时间0.01s;调制频率10

2、0KHz。以每毫克干细胞引起的ERP信号强度的绝对值表示细胞内总活性氧的相对含量。I.5.3蛋白质含量的测定:采用考马斯亮监染色法,取1mL待测液加入3m1.考马斯亮蓝染色液,以蒸馏水为对照,600nm下测量其吸光度。I.5.4胞外过氧化物酶(POD)酶活分析:存50ml,100mmol/L的磷酸盐缓冲液中加入281aL愈创木酚,溶解冷却后加入19i-1。30%的H:O:做为POD反应液。取05mL待测液与2mLPOD反应液和1mL,02mol/L的磷酸二氢钾反应,卜470nm处每隔lrain测其吸光度,以AA。,。/△t表示酶活大小”。1.5.5胞内过氧化氢酶(C

3、AT)酶活分析:501一L待测液巾加入3mL,06%的过氧化氢后,于240rim处测15s、30s时的吸光度,以△4:。/At表示酶活大小”1。1.5.6超氧化物岐化酶(SOD)酶活分析:取0.25mL胞内待测液,加入lmL,0.05mol/L,pH=7.8的磷酸盐缓冲液、lmL2.45mmol/LNB711后,于400Lux荧光灯下照射20min,在560儿m处测量其口发光度,以△4/△k0.I/20rain为一个酶活单位。1.6苯丙氨酸解氨酶(PAL)活力的测定取1mL胞内待测液.加人2mL0.01mollL的H,B04缓冲液,1mL002mol/L的苯丙氨酸和

4、1mL蒸馏水,混匀后于30。c恒温水浴中反应60nfin,在290nm处测量吸光度,以0.olmL蒸馏水为对照。以△A,△t=0.1160min为一个酶活单位。1.7胞内、外紫杉醇的提取及测定”’将培养液在6000r/min条件下离心20mln,细胞作为提取胞内紫杉醇的材料,离心后的j:清液用于胞外紫杉醇的提取。即取8mL上清液,加入10mL二氯甲烷,然后静置8h,收集二氯甲烷相,上相再重复提取共3次,之后合并二氯甲烷相,于窜温下风干。用于高教液相色潜法(HPLC)分析。将离心后所得的细胞,用液氮迅速冷冻,再进行冷冻干燥,所得的细胞干粉IHj于胞内紫杉醇的捉取。称取

5、100rag十细胞.在研钵中研成粉术状.加人5mL环已烷,研磨后加入20mL环已烷,将混合液倒入离心管中静置0.5h,弃去环己烷相,向沉淀巾加入lOmL甲醇和10mL一氯甲烷,超卢振荡节取30n,in,然后力u人20m1.蒸馏水充分混匀并静置10h,收集■氯甲烷相,刘上相再重复提取2次,台并一氯甲烷相,于室温下风干。用于HPI。C分析。紫杉醇的测定采用HPLC,将所得的样品用1mL色谱甲醇溶解,在C—18反相硅胶往(KromalilC.。5,um250×4.6nm)上进行恒速洗脱。流速控制存1ml/rain,流动相为色谱甲醇:水(65:35)的溶液。检测波氏为227

6、nm,总洗脱时J捌为40r,fin。2结果与讨论2.1真菌诱导子对胞内、外蛋白质的影响真南诱导子能引起细胞的代澍变化,它不仅使细胞积极合成了植物防甲的次生代谢物质,盘u植保素、术质素等,同时也扁动或加强了特定的7欠牛代澍途径,而这些过程的发生主要是通过酶类的调控来实现的,僵白质的含量变化【F反应了这些酶类的量变过程。本文在加入济导子Fo后,蛋白质的量发生了明显的变化。如网1所示,添导组胞内蛋白的含量出现了先高于后低于对照组的现象,这很吖能是细胞膜通透性改变及生白质合成速率发生变化共同作用的结果。而胞外蛋山,如图2所不,其含量诱导组始终高于对胃f{组,诱导初期,细胞生

7、长速率相对还仍然较大,因此胞外蛋白质含量呈下降趋势。而诱导子的加入一般都会导致细胞生长的停Ih甚至死亡,因此存加入诱导了后8h左右胞外货白含黾达到低峰,当细胞逐渐进入半稳期时,与各种次生代谢相关酶相继合成,使胞外蛋[J含量平稳上升。诱导末期,由1:诱导作,L}J使细胞的死亡率增大造成胞内蛋白的外泄,使这种趋势加剧。冈I胞内蛋白质含拦的变化Fig1ChangesofintracellularproleineOlllen[inducedbyto瑚㈣姗㈣一龄毙瞻聪强万方数据万方数据万方数据真菌诱导子对悬浮培养南方红豆杉细胞态势及紫杉醇合成的影响作者:张长平,李春,元英

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1、万方数据万方数据张长平等:真菌诱导子对悬浮培养南方红且杉细胞态势及紫杉醇什成的影响0.1moi/L磷酸盐缓冲液配制而成的含有0.2mol/LEDTA,DTID.4mmol/l,的细胞提取液,低温(4℃)离心后取上清液为胞内待测液。1.5.1培养液pII的测定:采用PHS.2型精密酸度汁(上海雷磁仪表厂)测定。1.5.2细胞内总活性氧相对含量的测定:细胞经冷冻干燥后,取一定量细胞干粉用ESR—SPECTROME—TER检测其顺磁共振图谱,以MnO,为标准校准磁场。测定条件为:微波功率,1mW;扫场时间8min/360mm;调制幅度2G;响应时间0.01s;调制频率10

2、0KHz。以每毫克干细胞引起的ERP信号强度的绝对值表示细胞内总活性氧的相对含量。I.5.3蛋白质含量的测定:采用考马斯亮监染色法,取1mL待测液加入3m1.考马斯亮蓝染色液,以蒸馏水为对照,600nm下测量其吸光度。I.5.4胞外过氧化物酶(POD)酶活分析:存50ml,100mmol/L的磷酸盐缓冲液中加入281aL愈创木酚,溶解冷却后加入19i-1。30%的H:O:做为POD反应液。取05mL待测液与2mLPOD反应液和1mL,02mol/L的磷酸二氢钾反应,卜470nm处每隔lrain测其吸光度,以AA。,。/△t表示酶活大小”。1.5.5胞内过氧化氢酶(C

3、AT)酶活分析:501一L待测液巾加入3mL,06%的过氧化氢后,于240rim处测15s、30s时的吸光度,以△4:。/At表示酶活大小”1。1.5.6超氧化物岐化酶(SOD)酶活分析:取0.25mL胞内待测液,加入lmL,0.05mol/L,pH=7.8的磷酸盐缓冲液、lmL2.45mmol/LNB711后,于400Lux荧光灯下照射20min,在560儿m处测量其口发光度,以△4/△k0.I/20rain为一个酶活单位。1.6苯丙氨酸解氨酶(PAL)活力的测定取1mL胞内待测液.加人2mL0.01mollL的H,B04缓冲液,1mL002mol/L的苯丙氨酸和

4、1mL蒸馏水,混匀后于30。c恒温水浴中反应60nfin,在290nm处测量吸光度,以0.olmL蒸馏水为对照。以△A,△t=0.1160min为一个酶活单位。1.7胞内、外紫杉醇的提取及测定”’将培养液在6000r/min条件下离心20mln,细胞作为提取胞内紫杉醇的材料,离心后的j:清液用于胞外紫杉醇的提取。即取8mL上清液,加入10mL二氯甲烷,然后静置8h,收集二氯甲烷相,上相再重复提取共3次,之后合并二氯甲烷相,于窜温下风干。用于高教液相色潜法(HPLC)分析。将离心后所得的细胞,用液氮迅速冷冻,再进行冷冻干燥,所得的细胞干粉IHj于胞内紫杉醇的捉取。称取

5、100rag十细胞.在研钵中研成粉术状.加人5mL环已烷,研磨后加入20mL环已烷,将混合液倒入离心管中静置0.5h,弃去环己烷相,向沉淀巾加入lOmL甲醇和10mL一氯甲烷,超卢振荡节取30n,in,然后力u人20m1.蒸馏水充分混匀并静置10h,收集■氯甲烷相,刘上相再重复提取2次,台并一氯甲烷相,于室温下风干。用于HPI。C分析。紫杉醇的测定采用HPLC,将所得的样品用1mL色谱甲醇溶解,在C—18反相硅胶往(KromalilC.。5,um250×4.6nm)上进行恒速洗脱。流速控制存1ml/rain,流动相为色谱甲醇:水(65:35)的溶液。检测波氏为227

6、nm,总洗脱时J捌为40r,fin。2结果与讨论2.1真菌诱导子对胞内、外蛋白质的影响真南诱导子能引起细胞的代澍变化,它不仅使细胞积极合成了植物防甲的次生代谢物质,盘u植保素、术质素等,同时也扁动或加强了特定的7欠牛代澍途径,而这些过程的发生主要是通过酶类的调控来实现的,僵白质的含量变化【F反应了这些酶类的量变过程。本文在加入济导子Fo后,蛋白质的量发生了明显的变化。如网1所示,添导组胞内蛋白的含量出现了先高于后低于对照组的现象,这很吖能是细胞膜通透性改变及生白质合成速率发生变化共同作用的结果。而胞外蛋山,如图2所不,其含量诱导组始终高于对胃f{组,诱导初期,细胞生

7、长速率相对还仍然较大,因此胞外蛋白质含量呈下降趋势。而诱导子的加入一般都会导致细胞生长的停Ih甚至死亡,因此存加入诱导了后8h左右胞外货白含黾达到低峰,当细胞逐渐进入半稳期时,与各种次生代谢相关酶相继合成,使胞外蛋[J含量平稳上升。诱导末期,由1:诱导作,L}J使细胞的死亡率增大造成胞内蛋白的外泄,使这种趋势加剧。冈I胞内蛋白质含拦的变化Fig1ChangesofintracellularproleineOlllen[inducedbyto瑚㈣姗㈣一龄毙瞻聪强万方数据万方数据万方数据真菌诱导子对悬浮培养南方红豆杉细胞态势及紫杉醇合成的影响作者:张长平,李春,元英

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