限制性核酸内切酶培训讲学.ppt

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1、限制性核酸内切酶郭三堆2013年CCTV年度科技创新人物中国“抗虫棉”之父郭三堆的团队在抗虫棉的培育中运用了哪些技术？所用技术主要包括哪些具体环节？从基因文库中获取聚合酶链式反应（PCR）扩增化学合成法目的基因的核苷酸序列未知目的基因的核苷酸序列已知1.郭三堆团队是如何获取目的基因的?2.基因工程的核心是什么?构建重组DNA分子3.需要用到哪些工具?限制性核酸内切酶、DNA连接酶、载体限制性核酸内切酶（1）作用对象：DNA(2010·浙江卷，2)在用基因工程技术构建抗除草剂的转基因烟草过程中，如下操作错误的是(

2、　　)A．用限制性核酸内切酶切割烟草花叶病毒的核酸B．用DNA连接酶连接经切割的抗除草剂基因和载体C．将重组DNA分子导入烟草原生质体D．用含除草剂的培养基筛选转基因烟草细胞A烟草花叶病毒（2）作用特点：识别和切割DNA分子内一小段特殊核苷酸序列5’5’5’5’3’3’3’3’使用DNA连接酶制作重组DNA分子CTTCATGAATTCCCTAAGAAGTACTTAAGGGATTGCTTAAAATTCGGCTTAAAATTCG目的基因质粒加入DNA连接酶后，可能生成的产物有哪些?目的基因和质粒的连接产物是否一定符合

3、要求?4.郭三堆团队选用的载体是什么？常用载体有哪些？（1）载体的种类：质粒、λ噬菌体和动植物病毒。下列与基因工程载体有关的叙述正确的是（）A．质粒是最常用的载体，在细菌中以独立于拟核之外的方式存在B．质粒作为载体的原因之一是它为环状，便于切割后与目的基因连接C．载体中的标记基因可促进目的基因的表达D．当受体细胞为大肠杆菌时，多种噬菌体均可作为载体，如λ噬菌体和T2噬菌体A（2）载体的必要条件能在受体生物细胞内稳定保存，并大量复制和表达有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段插入。具有某些标记基因，便于筛选。

4、5.抗虫基因是如何导入棉花细胞的？①农杆菌转化法②花粉管通道法如何将目的基因导入动物细胞？显微注射技术：将基因表达载体提纯，用显微仪注射到受精卵中如何将目的基因导入细菌？用Cacl2处理细胞，增大细胞壁的通透性四环素抗性基因目的基因6.若某受体细胞表达了标记基因，是否意味着导入了目的基因？四环素抗性基因受体细胞四环素抗性蛋白四环素抗性基因四环素抗性基因氨苄青霉素抗性基因目的基因1.请指出符合生产要求的大肠杆菌菌落2.除利用标记基因筛选是否导入目的基因之外，你还有什么办法进行筛选？为了检测目的基因是否导入原本没有氨

5、苄青霉素抗性基因和四环素抗性的大肠杆菌，将大肠杆菌在含四环素的培养基上培养，得到如图二的菌落。再将灭菌绒布轻轻按在培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布平移按到含氨苄青霉素的培养基上培养，得到如图三的结果(空圈表示与图二对照无菌落的位置)。3.上述筛选出来的受体细胞是否一定能表达目的基因？核酸分子杂交A培养基含四环素B培养基含氨苄青霉素7.请猜测郭三堆团队检测目的基因表达的方法让棉铃虫吃棉花叶片，若表达成功，棉铃虫会死亡个体水平若某些目的基因表达后在个体水平的表现不明显，你还有什么办法检测目的基因是否成功表达？分

6、子水平抗原—抗体杂交8.抗虫基因会导入到什么部位呢？会导入几个？目的基因插入位置和数目具有随机性BBBBABBBC某农业研究所将苏云金芽孢杆菌的抗虫基因（Bt）导入棉花，筛选出Bt基因成功整合到染色体上的抗虫植株（假定Bt基因都能正常表达）。某些抗虫植株体细胞含两个Bt基因，这两个基因在染色体上的整合情况有下图所示的三种类型（黑点表示Bt基因的整合位点）；让这些含两个Bt基因抗虫的植株自交，后代含抗虫基因的个体的比例由大到小顺序为A．甲、丙、乙 B．甲、乙、丙C．丙、乙、甲  D．乙、甲、丙A9.单一基因培育出的

7、转基因抗虫棉,虽然具有许多优点,但也存在着许多不足,如抗虫范围相对较窄,抗虫性还不是特别强。为提高棉花对害虫的抗虫能力，可采取什么措施？根据导入外源基因种类数的不同,转基因抗虫棉又可分为：单价转基因抗虫棉、双价转基因抗虫棉、多价转基因抗虫棉等基因工程利用某目的基因(图甲)和P1噬菌体载体(图乙)构建重组DNA(图丙)。限制性核酸内切酶的酶切位点分别是BglⅡ(A↓GATCT)、EcoRⅠ(G↓AATTC)和Sau3AⅠ(↓GATC)。下列分析合理的是A．用EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体B．用BglⅡ和Ec

8、oRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体C．用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体D．用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体基因工程利用某目的基因(图甲)和P1噬菌体载体(图乙)构建重组DNA(图丙)。限制性核酸内切酶的酶切位点分别是BglⅡ(A↓GATCT)、EcoRⅠ(G↓AATTC)和Sau3AⅠ(↓GATC)。下列分析合理的是A．用EcoR