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1、第一章工具酶主要内容一．限制性核酸内切酶二．其它工具酶1．DNA连接酶2．聚合酶3．DNA修饰酶4.细胞裂解酶一．限制性核酸内切酶1.限制性核酸内切酶的定义与特点2.限制性核酸内切酶的发现3.限制和修饰作用的分子机制4.限制性内切酶的分类5.限制性内切酶的命名6.II型限制性核酸内切酶的基本识别特性7.限制性内切酶的切割方式8.II型限制性核酸内切酶酶解反应的操作9.影响限制性核酸内切酶活性的因素及解决方法10.限制性内切酶的star活性11.其他特异性的限制酶12.DNA分子的片段化定义：一类能
2、识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核苷酸酶。特点：▲存在于任何一种原核细菌中.▲在特异位点上催化双链DNA分子的断裂,产生相应限制性片段.▲各种生物呈现特征性的限制性内切酶酶切图谱.▲在生物分类,基因定位,基因重组,疾病诊断,刑事侦察领域极为重要.限制性内切酶的发现：宿主细胞的限制和修饰作用1.两种不同来源的λ-噬菌体,λK；λB.2.能高频感染各自大肠杆菌宿主细胞（λK→K株,λB→B株）3.当它们分别与其它宿主菌交叉混合培养时，感染下降数千倍。4.一但λ
3、K噬菌体在B株成功，由B株繁殖出λK后代，能感染B株,λK→B株.不能感染原来K株.λK×K株限制和修饰作用的分子机制1．大肠杆菌宿主细胞K株B株,有各自的限制和修饰系统。2.λ噬菌体长期生长在大肠杆菌宿主细胞K株，B株中.3．细菌利用限制和修饰系统来区分自身DNA与外DNA。4.C株不能产生限制性内切酶，其它来源λ-噬菌体可以感染C株，而在C株繁殖λ-噬菌体则在K株和B株,受到严格的限制作用。问题1.关于宿主控制的限制修饰现象的本质，下列描述中只有（）不太恰当。A。由作用于同一DNA序列的两种酶
4、构成B.这一系统中的核酸酶都是II类限制性内切酶C.这一系统中的修饰酶主要是通过甲基化作用对DNA进行修饰D.不同的宿主系统具有不同的限制－修饰系统2.判断下面一句话是否正确限制与修饰现象是宿主的一种保护体系，它是通过外源DNA的修饰和对自身DNA的限制实现的。1）它们均有三个连续的基因位点控制，hsdR;hsdM;hsdS.2）hsdR编码限制性核酸内切酶---识别DNA分子特定位点，将双链DNA切断。（注意：DNA分子转化细胞：受体细胞去掉hsdR基因位点）3）hsdM编码产物是DNA甲基化酶
5、---催化DNA分子特定位点的碱基甲基化反应。4）hsdS表达产物的功能是---协助限制性核酸内切酶和甲基化酶，识别特殊的作用位点。限制和修饰作用的分子机制1）宿主细胞甲基化酶，将染色体DNA和噬菌体DNA特异性保护,封闭自身所产生的核酸内切酶的识别位点。（修饰）2)当外来DNA入侵时，遭到宿主限制性内切酶的特异降解。（限制）限制和修饰作用的分子机制3)由于降解不完全，外来少数DNA分子在宿主细胞中繁殖过程中被宿主细胞的甲基化酶修饰，虽然是外来却不被降解。4)外来少数DNA分子,虽然是外来却不被降
6、解。但丧失在原宿主细胞中的存活能力，因为接受了新宿主菌甲基化修饰的同时丧失了原宿主菌修饰的标记,一但λ-K噬菌体在B株成功，由B株繁殖出λ-K后代能感染B株,不能感染原来K株.限制性内切酶的分类：（三大类）I．I类，II类,III类.2．I类，III类为限制---修饰酶。限制性内切活性和甲基化活性，都作为亚基的功能单位包含在同一酶分子中。3．II类限制性内切酶与甲基化酶是分离的，切割位点专一，适合于DNA重组。限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的分类主要类型I型II型III型限制修饰多功能单功能双功
7、能蛋白结构异源三聚体同源二聚体异源二聚体辅助因子ATPMg2＋SAMMg2＋ATPMg2＋SAM识别序列无规律，如EcoK：旋转对称无规律，如EcoP15：AACN6GTGCCAGCAG切割位点距识别序列1kb识别序列内或附近距识别序列下游处随机性切割特异性切割24－26bp处问题：1.下面关于限制酶的叙述中哪些是正确的？（）A.限制酶是外切酶而不是内切酶B.限制酶在特异序列（识别位点）对DNA进行切割C.同一种限制酶切割DNA时留下的末端序列总是相同D.一些限制酶在识别位点内稍有不同的位置切割双
8、链，产生黏末端E.一些限制酶在识别位点内相同的位置切割双链DNA,产生平末端2.II类限制性内切酶（）A.有内切核酸酶和甲基化酶活性且经常识别回文序列B.仅有内切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一种酶提供C.限制性识别非甲基化的核苷酸序列D.有外切核酸酶和甲基化酶活性E.仅有外切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一种酶提供限制性核酸内切酶的命名名称属名（大写、斜体）种名（小写、斜体）株名序数来源菌株EcoRIEcoRIE.coliR株HindIIIHindIIIHaemophilusin
