重组dna技术的操作过程教学文案.ppt

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1、重组DNA技术的操作过程ADNA的体外重组（切与接）3重组DNA技术的操作过程同种内切酶生产的粘性末端的连接同尾酶生产的粘性末端的连接不同粘性末端的连接人工粘性末端的连接重组率基于同源重组的In-Fusion连接同种内切酶生产的粘性末端的连接5'5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRI5'GCTTAAAATTCG5'5'GCTTAA5'5'AATTCG5'退火GCTTAAAATTCG5'GCTTAA5'AATTCGGCTTAAAATTCG5'GCTTAA5'AATTCGT4-DNA

2、ligaseGAATTCCTTAAG5'5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5'5'GAATTCCTTAAG同尾酶生产的粘性末端的连接BamHI5'5'GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5'GCCTAGGATCCG5'5'TACTAG5'5'GATCAT5'退火GCCTAGGATCCG5'TACTAG5'GATCATT4-DNAligaseTGATCCACTAGG5'5'GGATCACCTAGT5'TGATCAACTAGT5'BclIGCCTAGGATCCG5'TACTAG

3、5'GATCATTGATCCACTAGG5'5'GGATCACCTAGT不同粘性末端的连接BamHI5'5'GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5'GCCTAGGATCCG5'5'CTGCAG5'GACGTC3'T4-DNAligaseCGATCCGCTAGG5'5'GGATCGCCTAGC5'CTGCAGGACGTC5'PstI3'T4-DNApol切平5'CG5'GCKlenow补平5'GGATCCCTAGGATCC5'CTAGGCGATCCGCTAGG5'5'GGATCGCCTAGC人

4、工粘性末端的连接5‘突出末端5'GCCTAGGATCCG5'5'GCTTAA5'5'5'AATTCGT4-DNAligase5'5'Klenow补平Klenow补平5'GGATCCCTAGGATCC5'CTAGG5'GAATTCTTAA5'5'5'AATTCTTAAGTdTTdTdGTPdCTPGAATTGGGGGGCTTAAAATTCGGGGGGTTAAGGGATCCCCCCCCCTAGGATCCCCCCCCCTAGGGAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCC

5、CAATTCCCTAGGGGGGGTTAAG5'5'GAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAG退火BamHIBamHIEcoRIBamHI人工粘性末端的连接3‘突出末端CTGCA3'GG3'ACGTC5'GCATG3'C5'C3'GTACGT4-DNAligaseTdTTdTdCTPdGTPGCATGCCCCCC3'C退火PstIPstIC3'CCCCCCGTACGCTGCAGGGGGG3'GG3'GGGGGGACGT

6、C5'5'GCATGCCCCCCGCGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCGCCCCCCGTACG5'5'GCATGCCCCCCGCGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCGCCCCCCGTACG5'5'GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACG5'5'GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACGKlenowPstISph

7、I人工粘性末端的连接平头末端C3'GG5'G3'C5'C3'GT4-DNAligaseTdTTdTdTTPdATPGTTTTTTTTTT3'C退火C3'TTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAA3'GG3'AAAAAAAAAAC5'5'GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTGS1C3'5'5'GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTG加热GTCATTTTTTTTTGAAAAAAAAACCAGT

8、AAAAAAAAACTTTTTTTTTGTGACCAGT基于同源重组的In-Fusion连接载体质粒重组质粒每条引物外侧设计含有与载体相应末端同源的15个碱基序列引物引物In-Fusion酶加入In-Fusion酶37℃15min+50℃15minPCR扩增转化重组率重组率的定义重组率=含有外源DNA的重组分子数/载体分子总数；在常规实验条件下，重组率一般为25-75%；重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以大大简化DNA重组