rnai抗猪繁殖和呼吸综合征病毒探究进展

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RNAi抗猪繁殖和呼吸综合征病毒探究进展　　摘要：猪繁殖与呼吸综合征（Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS）是世界上主要的猪传染性疾病之一，以妊娠母猪发热、厌食、早产、流产、死胎等繁殖障碍及仔猪高死亡率和育成猪呼吸困难，类流感症状、发育迟缓为主要的特征。该病给各个国家的养猪业带来巨大的经济损失，目前，疫苗和抗病毒药物只能提供有限的保护。自2006年以来，不断有研究者应用RNA干扰（RNAinterference，RNAi）技术开展抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的研究，并取得了一些阶段性成果。对已有的研究成果进行了综述。关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒；RNAi；抗病毒中图分类号：S852.6文献标识码：B文章编号：1007-273X（2013）05-0061-04猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV）属套式病毒目（Nidovirales）动脉炎病毒科（Arteriviridae）动脉炎病毒属（Arterivirus）成员[1]，是一种有囊膜的单链正股RNA病毒。该病毒可持续性感染猪，引起免疫抑制，目前此病已经成为危害世界养猪业安全的重要病原之一[2]。近年来，PRRSV15 病毒的变异导致高致病性PRRSV的出现，给中国养猪业带来致命的灾难。然而，目前使用的PRRSV疫苗只能部分阻止临床症状的出现，不能防治PRRSV感染，另外不同毒株间的交叉保护力也较低，因此人们对新型防控策略的研发充满了期待。RNA干扰（RNAinterference，RNAi）是由小干扰RNA（smallinterferingRNA，siRNA）或微RNA（microRNA，miRNA）所引起的以序列特异性方式介导的靶mRNA降解或翻译抑制的基因调控方式[3]，同时又是一种保守的抗病毒机制。近年RNAi技术已被用于干扰抑制多种人或畜类病毒的复制和感染研究。与传统疫苗预防和药物治疗相比，由于RNAi技术能够从源头上有效地抑制病毒抗原基因的表达，因此RNAi也许是一种更有效的抗病毒策略，尤其是在动物传染性疾病的防治方面，越来越多的证据也表明，RNAi是生物体内一种古老而保守的抗病毒免疫形式。对病毒而言，无论是DNA还是RNA病毒，只要其在细胞中经历RNA的阶段，都可能成为RNAi的靶标。RNAi主要抗病毒机制为：病毒在动物细胞内的复制会产生dsRNA复制中间体，作为激活RNAi的作用因子，这些中间体经加工后形成沉默复合体，特异性地与目的病毒RNA或mRNA结合，并将其降解[4]。众多的研究已表明特异性siRNAs介导的RNAi可以抑制病毒的复制、减少病毒RNA15 的数量和阻断病毒蛋白的表达，在病毒病的治疗上显示出一定效果[5，6]。但是病毒的进化和快速变异使其干扰siRNA和微RNA（miRNA）介导的沉默通路的能力也越来越强，在宿主细胞内病毒和宿主细胞RNAi的抑制作用展开了“博弈”，病毒只有能够逃逸宿主细胞RNAi这种基于核酸的免疫系统方能生存[7]。病毒逃避RNAi的可能分子机制：一般来说，RNA病毒主要通过靶区域的突变或编码病毒抑制子来逃避RNAi介导的抑制，或两者兼有，而DNA病毒则倾向于利用病毒抑制子逃避宿主RNAi[8，9]。理解了病毒逃避RNAi的分子机制，我们才能更好的设计避免病毒产生抗性的高效RNAi片段。1microRNA（miRNA）抑制PRRSV的相关研究进展近年来，Xiao15 等[10]对人工合成的microRNAs在MARC-145细胞中抑制高致病性PRRSV的复制进行了研究，该研究团队设计了分别靶向H-PRRSV主要结构蛋白GP5、M蛋白编码基因的5个amiRNAs，即基于小鼠miR-155设计的由PolII启动子驱动表达的pre-amiRNA表达载体上，使得这些amiRNAs能够像内源性的microRNA一样被加工成熟。结果5个amiRNAs对靶基因表达的抑制效率均在70%以上。amirGP5-370能在转录和翻译水平有效抑制靶基因的表达，并能抑制H-PRRSV在MARC-145细胞中的复制。当amirM-263与其自身串联一次后置于同一个表达框中时，串联表达的amirM-263能有效抑制H-PRRSV感染过程中靶基因的表达和病毒复制。双荧光素酶报告实验表明，串联表达amirGP5370和amirM-263能够同时抑制GP5与M蛋白编码基因表达。Xia等[11]也针对PRRSV的5’或3’UTR非翻译区，人工合成6个microRNAs进行研究，结果发现有4个amicroRNAs能有效抑制PRRS病毒的复制。microRNA的研究发现进一步提高了RNAi的有效性。利用内源性microRNA的表达调控来控制PRRSV的发展是一条新的途径。2RNAi在抗猪繁殖与呼吸综合征病毒方面的研究2.1针对猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF1的RNAi的研究进展做RNAi实验中，在选取目的基因时，应选取保守的、并对病毒生长繁殖影响大的基因，该基因不能与宿主基因有同源性，从而在预防和治疗病毒性疾病上才能发挥作用。在不同的毒株之间ORF1b比ORF1a更保守。所以针对ORF1设计的干扰靶位一般选在ORF1b区。通过文献整理发现，目前共有2个研究团队针对PRRSV的ORF1b保守区域设计了干扰片段，Li等[12-14]针对PRRSVS1株设计的pSUPER-P2和pSUPER-P3的shRNA表达质粒，在MARC-145上明显抑制了PRRS病毒的复制，且ORF1b编码的基因和蛋白的表达都下调几十倍，结果证明ORF1b编码的非结构蛋白质在PRRSV复制过程中起到了重要作用。15 同时他们又将pSUPER-P2和pSUPER-P3克隆到腺病毒载体上，转染感染PRRSV的MARC-145和猪肺巨噬细胞（PAM），结果2个shRNA重组腺病毒组中TCID50、靶基因mRNA和蛋白质水平均明显低于PRRSV对照组，对病毒复制的抑制效力为100～1000倍。ORF1b转录产物的减少可以直接影响病毒在感染早期结构蛋白的表达与合成，从而影响到病毒粒子的装配。而且rAd-P2可以在猪体内有效抑制PRRSV的复制，推迟动物发病3d左右。证明shRNA重组腺病毒在体内外均能有效抑制PRRSV复制，为控制PRRSV感染提供了一种可能的新策略[14]。Bao等[15]也针对PRRSV-JXwn06的ORF1b设计5对干扰片段，结果筛选到2对有效片段pGenesil-1-1b-135和pGenesil-1-1b-372，这进一步证明ORF1b编码基因和蛋白的功能，同时也证明了靶位点的选择影响RNAi的效果。　　2.2针对猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组次要结构蛋白的RNAi的研究进展GP2、GP2b、GP3和GP4是次要的结构蛋白，针对PRRSV的次要结构蛋白的RNAi比较少，国内研究团队主要是贺云霞等[16]针对PRRSVCH-1a分离株（GenBank登录号AY032626）的GP2、GP3、GP4蛋白区构建了12个短发夹结构表达载体，转染MARC-145细胞，结果筛选到5对能明显抑制病毒复制的片段，但ORF2、ORF3或ORF4的减少并未明显影响病毒粒子的组装，不过减少GP3mRNA15 能够影响感染细胞中的病毒滴度，表明GP3在PRRSV复制或感染中有重要作用。2.3针对猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组主要结构蛋白的RNAi的研究进展GP5、M和N是主要的结构蛋白，且它们在整个病毒复制中起重要作用，且在同一基因型毒株间相对保守。因此研究者在设计针对PRRSV的干扰实验时，主要以GP5、M和N蛋白基因作为靶标。PRRSVGP5蛋白是由ORF5编码的PRRSV最重要结构蛋白，也是变异性较高的糖蛋白，其N端有一个信号肽，是GP5的高变异区。有关PRRS病毒致病机制的研究发现，克隆于哺乳动物痘病毒载体的ORF5表达产物可诱导细胞凋亡，表明GP5蛋白可能与疾病发生有关[17，18]。Wissink等[19]研究发现PRRSV病毒体的形成依赖于GP5、M这两个主要包膜蛋白，如缺少它们，就不能释放出病毒粒子。研究者们针对猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）JL/07/SW株、PRRSV-S1株和PRRSV-JXwn06株GP5基因设计了干扰靶位，结果证实构建的部分干扰质粒可以高效抑制PRRSV在MARC-145细胞中的复制，说明GP5基因是PRRSV复制所必需的[12，15，20，21]。基质蛋白（M蛋白）由ORF6编码是欧美毒株之间较为保守的蛋白[9]。黄娟[22]和Bao15 等[15]研究团队也针对不同毒株株的ORF6区设计了干扰片段。最终都筛选到有效抑制PRRSV复制的片段。Xiao等[10]则利用慢病毒载体构建的对抗GP5和M蛋白的amiRNA能够抑制高致病性的PRRSV在MARC-145细胞中的复制。这一发现表明猪体内可能存在一类能够抑制PRRSV复制的microRNAs，或者PRRSV本身可能编码microRNA。我们通过调节猪内源性microRNA的表达量或者抑制病毒本身编码的microRNA的表达，都有可能从根本上抑制各类PRRSV毒株的复制，找到治疗PRRS的治疗药物和方法。ORF7编码病毒的核衣壳蛋白（N）。在PRRSV感染细胞内表达水平最高，占病毒粒子总蛋白量的20%～40%，是病毒的优势结构蛋白。且在欧、美2种基因型中，N蛋白高度保守[23]。且如果抑制其表达整个PRRSV粒子将不能够包装成功[24]。黄娟[22]构建了4个靶向PRRSVN蛋白基因的shRNA表达质粒，结果表明pSUPER-N3对PRRSV的复制有明显的抑制效果。将这两种质粒共转染MARC-145细胞，发现shRNA表达质粒对病毒复制的抑制作用具有相加性，而且用shRNA表达质粒转染已经感染PRRSV的Marc-145细胞，病毒的复制也得到了抑制。研究人员还发现针对N基因的干扰片段可有效抑制病毒复制的片段，证实N基因可能是病毒复制所必需的结构基因[25，26，10，27-29，]。15 2.4针对猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组3’UTR和5’UTR的RNAi的研究进展黄娟[22]还通过干扰实验证实针对PRRSV的5’UTR设计的干扰片段对病毒复制的影响并不显著。但是，Xia等[11]则针对PRRSV-VR2332（ATCCVR2332），PRRSV-CH-1R，PRRSV-JXA1的3’UTR和5’UTR在体外人工合成6个amicroRNA干扰片段，结果有4个amicroRNAs有效地抑制了PRRSV病毒的复制。这与小siRNA干扰结果是不同的，但这并不矛盾。因为我们知道，shRNA编码的siRNA需要与其绑定的靶位点序列完全匹配才能发挥作用，而microRNA与其靶序列的作用只需要8个种子碱基配对即可。同时也说明microRNA具有更强的干涉病毒复制的效果。尽管之前的研究表明针对PRRSV编码区抑制病毒复制的效果是非常显著的，但从遗传学角度讲，每种基因型的病毒在序列和毒力方面的变异速度是非常快的。但是同一基因型的病毒非编码区却是相对保守的，序列同源性也较高。如果我们能针对PRRSV不同毒株相对保守的非编码区设计稳定表达的干扰序列，那么就有可能建立更全面的抗PRRSV不同毒株感染的战略方法。3展望RNAi作为一项新技术，已经成为研究基因功能的新工具，研究信号传导通路的新途径，开展基因治疗的新策略。RNAi15 有抵抗病毒入侵，抑制转座子活动等作用，因此可以利用RNAi现象产生抗病毒的植物和动物，并可利用不同病毒转录序列中高度同源区段相应的dsRNA抵抗多种病毒。尽管RNAi技术在抗病毒感染方面己显示出广阔的应用前景，但目前对RNAi机制尚不完全清楚，比如RISC的形成、组成成分、如何切割mRNA；siRNA靶位点的选择；siRNA的稳定性以及对正常细胞有无影响；外源siRNA怎样适时、适地、安全的导入机体靶器官并被组织细胞摄取，这些问题都有赖于RNAi的进一步发展。目前，人工体外合成的microRNA对PRRSV的抑制作用，为针对PRRSV的RNAi研究带来新的希望。microRNA是一个庞大的小分子调控RNA家族，广泛存在于各种动植物中，参与细胞增殖和分化、细胞凋亡、胚胎发育、形态建成以及疾病发生等一系列重要的生命过程。相信RNAi中存在的一系列问题将不断地得到解决。内外源性的RNAi作为新的基因治疗剂都将更加广泛地应用于动物乃至人畜共患疾病的治疗中，真正实现临床应用，最终成为防治动物疫病的有效手段。也许在1～2年内，我们就有可能看到基于microRNA的治疗方法。　　参考文献：[1]COLLINSJE，BENFIELDDA，CHRISTIANSONWT，etal.Isolationofswineinfertilityandrespiratorysyndromevirus（isolateATCCVR-2332）inNorthAmericaandexperimentalreproductionofthe15 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