血片的制作和染色精讲说课材料.ppt

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1、血片的制作和染色精讲人体疟原虫的基本结构疟色素不着色，颜色和颗粒的形状，因疟原虫种类而异。间日疟原虫的色素颗粒呈细小杆状，黄褐色；恶性疟原虫色素呈块状，黑褐色；三日疟原虫的色素呈砂粒状，深褐色；卵形疟原虫的色素与间日疟原虫相似。疟色素在虫体内散在分布或聚集成团块。设备载玻片新玻片把玻片浸入有液态洗涤剂清水中10~20分钟，然后用干净棉巾逐个擦拭，再放入盛有清水的容器中换水3~4次，凉干，最后用干净柔软的棉巾将玻片擦亮。用于特殊目的玻片，上述处理后将玻片浸在95％乙醇5~10分钟，再擦干擦亮。设备旧玻片将玻片浸泡于洗涤剂溶液中1~2天，或浸泡于煮沸的5％肥皂水1~2小时，再移到新配置的

2、洗涤剂溶液中1~2小时，擦去玻片上的血痕，用清水漂洗3~4次，再将玻片擦干擦亮。玻片包装洗净的玻片每10~20张用白纸包好放入塑料袋内，保存于干燥环境中备用。设备采血针使用一次性采血针。玻片盒为防止污染和苍蝇吸食血膜，新血片应放在玻片盒内，厚血膜要保持水平，直到充分干燥。75％乙醇棉球用于采血前后消毒。记号笔用于记录血片号码。试剂染色液种类以碱基美蓝液和酸性伊红液混合的多色性染剂（美兰、伊红和由美兰氧化所成的天青）配制的多色性染液分为两类：水溶液：罗氏（Romanowsky）染液、西氏（Simon)、J.S.B氏染液、费氏(Field)等；醇溶液：吉氏（Giemsa）染液、瑞氏（Wr

3、ight）染液、利氏（Leishman）等。试剂染色原理伊红是酸性水溶性钠盐，美兰是碱性水溶性盐酸盐，当它们各自溶化水中时，就离解为带阳电和阴电的离子。伊红主要离解为酸性的阳离子，在遇到碱性的蛋白质（如血红蛋白、嗜伊红白血球颗粒等）可结合成不易溶于水的沉淀物染成红色。美兰主要离解为碱性的阴离子，美兰与疟原虫、淋巴和大单核细胞的胞浆、嗜碱性白细胞的颗粒等酸性蛋白质结合染成兰色。试剂吉氏（Giemsa’s）染液配制吉氏粉5.0g甲醇250ml甘油250ml将吉氏粉置于研钵中，加入少量甘油充分研磨，然后边加边磨，至加完甘油倒入500ml有塞玻璃瓶。在研钵中加入少量甲醇洗掉剩余部分倒入瓶内，

4、再加甲醇洗静研钵中甘油。塞紧瓶塞，充分摇匀，置室温内，每天用力摇动溶液5分钟，3天后即可使用。试剂瑞氏（Wright’s）染液配制瑞氏染剂粉1.0g甲醇500ml甘油15ml将瑞氏染剂粉置于研钵内，加入甘油充分研磨后，倒入有塞玻璃瓶中，再用甲醇洗研钵中的甘油，溶液倒入瓶中，摇匀后，置室温下，每天摇动5分钟，3天后即可使用。试剂染色用水常用的染液稀释和冲洗用水是中性蒸馏水或经煮沸过滤的冷开水。在没有蒸馏水时，也可用井水、河水、泉水或雨水。稀释和冲洗用水的pH值在7.0-7.2染色效果最佳。也可选用临时配制的PBS缓冲液，作为稀释和冲洗用水。试剂PBS缓冲液配制（0.01mol/lPBS

5、pH7.2）KH2PO40.38gNaHPO41.02g(或Na2HPO4·12H2O2.58g)NaCl8.00g蒸馏水加至1000ml血片制作取血时机现症病人随时取血，疟疾普查不考虑取血时机。但在诊断或需要某期疟原虫作标本时，应掌握适宜的取血时机。●一般患者发作数小时至十小时内，可见环状体,12～36小时发育至滋养体，36～48小时可见裂殖体，发作二次可见配子体。●恶性疟原虫裂体生殖在内脏毛细血管内进行，发作前末稍血液中不易查到。较理想的取血时间是在发作后20小时左右，初发患者退热后常查不到原虫。采血部位和方法通常耳垂取血，先用75%酒精棉球消毒取血部位，待酒精干后，用左手拇指和

6、食指紧捏耳垂上方，右手持消毒针迅速刺入皮肤，不宜过深或过浅。然后用右手中指轻轻挤压出血。厚血膜用右手大拇指和食指夹持推片两侧中部，用推片左下角从取血部位刮取约4～5μl血，使血滴与载玻片接触再由里向外一个方向旋转2~4圈，涂成直径0.8~1㎝圆形厚血膜。薄血膜用推片中部取血1~1.5μl，将推片与载玻片25~35度角接触，当血液在两侧扩展至约2㎝宽时，迅速向前推成长2.5㎝舌状薄血膜。厚、薄血膜的位置厚薄血膜标本片厚血膜血量适宜，不宜过多或过少。薄血膜无皱折和空泡，红细胞单层排列。染色吉氏染色先用甲醇固定薄血膜。成批染色时，将血膜朝一方向插入染色缸中，倒入新配制2％吉氏染液浸没厚薄血

7、膜染色30分钟，向染色缸中缓慢注入自来水至溢出，将染色缸中残余染液倾出，再加入新水反复冲洗2~3次，然后取出血片，将血膜朝下插在晾片板上晾干。单张血膜染色可取蒸馏水或PBS缓冲液2ml加入吉氏染液1~2滴，混匀后滴在厚薄血膜上染色20~30分钟，再按上述方法水洗、晾干。快染配制5%吉氏染液在2ml缓冲液或净水中直接滴加吉氏原液7滴，混匀，滴到待染标本的厚薄血膜上，染色10min，清水缓慢冲洗，晾干镜检。影响染色效果的因素血片玻片清洁，血膜制作质量。染剂和溶