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1、苯丙氨酸氨解酶基因预期目标遗传性缺乏苯丙氨酸羟化酶所致的苯丙酮尿症是人类常见的先天性苯丙氨酸代谢缺陷病，是引起先天性智力降低的主要原因之一。为防止痴呆的发生，在出生后至发育期必需服用不含或含极少量苯丙氨酸的合成食物，费用十分昂贵。用酶在肠道内/外将消化后的苯丙氨酸降解，是一个有希望的取代途径。预期目标苯丙氨酸氨解酶(L-phenylalanineammonialyase,PAL)广泛分布于植物和某些真菌中，它可使苯丙氨酸降解为无毒的苯丙烯酸。在动物实验中证明，口服该酶可降低实验性苯丙酮尿症动物血清中异常增高的苯丙氨酸浓度，已有学者研究将该酶固化后，口服用于治疗苯丙酮尿症
2、。尽管PAL在临床治疗应用中具有良好的前景，但无法从真菌和高等植物细胞中大量提取PAL，为此，试图应用基因工程技术探索从大肠杆菌中获取大量廉价的PAL，藉以通过口服在肠道内消除苯丙氨酸，或用于生产廉价的无苯丙氨酸食物，达到治疗苯丙酮尿症的目的。获取工程菌的过程目的基因的获取获取工程菌的过程二、重组子的制备及酶切分析：rPAL-1-cDNA大小为2519bp，pET-28c大小为5367bp，通过T4DNA连接酶连接后的重组表达质粒应为7886bp。挑取四个重组阳性克隆，经EcoRI酶切图谱鉴定，所得片段符合预计大小（见图2，lane2,4,6,8）。由于应用单酶切插入目
3、的基因所获得的重组质粒，存在着正反两种插入方向。为了获得所需的正向插入重组克隆，经查阅GenBank,在对rPAL-1-cDNA及pET-28c质粒的酶切图谱分析后，选用各自都只有一个酶切位点并能显著区分正反插入方向的BamHI进行酶切鉴定。根据理论分析，经BamHI酶切后可能出现的二种情况如下：正向插入生成的二个片段大小预计应为337bp和7549bp，反向插入分别为2194bp和5692bp（见图3）。四个重组克隆的BamHI酶切图谱见图2，lane1,3,5,7。由此可知，获得了3个正向插入重组克隆和1个反向插入重组克隆。获取工程菌的过程三、重组质粒测序：重组表达
4、质粒测序结果如图4所示，与设计时预期的完全相同。说明该重组质粒已正向插入目的基因，对阅读框架分析，完全肯定了该质粒能正确表达rPAL-1-cDNA。获取工程菌的过程重组子的转化按文献，将质粒pUC19-rPAL-1-cDNA转化大肠杆菌DH5α，并加以扩增。根据文献在水稻苯丙氨酸氨解酶基因（GenBank/EMBL,Accessionnumber:x16099）ATG下游131-112碱基段设计测序引物5'TGGATCTTGACCAGCGGCT3'，对pUC19-rPAL-1-cDNA质粒进行反向测序。测序按PerkinElmer公司推荐的BigDye标记终止碱基双脱氧
5、法在ABIPrismTM310自动序列分析仪上进行。根据测序结果，在表达质粒pET-28系列中，选择与之相匹配的表达载体。获取工程菌的过程筛选与鉴定用EcoRI酶将pET-28c从多克隆位点处切开，在其5'端用牛小肠碱性磷酸酶（CIP）脱去磷酸，纯化后溶于双蒸水中备用。用EcoRI酶切质粒pUC19-rPAL-1-cDNA，通过1.5%琼脂糖凝胶电泳分离（80V4h），切取2.5kb的rPAL-1-cDNA条带，用透析袋法回收，经酚、氯仿抽提，乙醇沉淀纯化，溶于双蒸水。按文献描述步骤用T4DNA连接酶将2.5kbrPAL-1-cDNA与5'端脱磷酸之线性pET-28c连
6、接重组成表达质粒，连接时取插入片段DNA与pET-28cDNA的摩尔比为3∶1。连接产物转化感受态大肠杆菌BL21DE3,在含有卡那霉素的LB平板上,筛选出阳性克隆。获取工程菌的过程根据rPAL-1-cDNA及pET-28c酶切图谱，选用BamHI酶切重组质粒，鉴定插入方向。并用测序引物对重组质粒PET-28c-rPAL-1-cDNA进行测序，进一步确定其插入方向及阅读框架。获取工程菌的过程工程菌的诱导表达及SDS-聚丙酰胺凝胶电泳分析：挑取正向插入克隆，接种于含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养16h,以1∶200比例接种于新鲜的含抗生素的培养基中,
7、37℃振荡培养2.5h进行扩增,取100mL菌液作为诱导前对照。然后加入终浓度为1mmol/L的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，在37℃振荡培养中诱导工程菌表达,分别于诱导1,3,5,7h四时间点取样,以BL21DE3及经pET-28c空载体转化的BL21DE3为对照，在超声裂解液中将大肠杆菌超声破碎，200W10s，停10s，重复10次。4℃15000r/min离心15min，上清液和沉淀分别进行10%SDS-聚丙酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，200V，30min，考马斯亮兰染色，结果经Kodakdigitalscienc
